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阿尔茨海默病(AD)是最常见的一种神经系统退行性疾病，主要临床表现为记忆和认知功能障碍、人格和行为改变。其特征性病理改变为：神经细胞外老年斑(SP)、神经细胞内神经纤维缠结(NFT)。但迄今为止，AD病因尚未完全阐明。
胆红素(Bilirubin，BR)是血红素的终末代谢产物，具有多种生物活性，能参与体内多种细胞活动。BR有亲脂性，能透过血脑屏障，对神经系统的毒副作用较大，但具体机制尚不清楚。据报道称AD患脑脊液BR水平显著高于正常对照。还有人认为血液中的BR可作为诊断AD发病的生物指标。这些说明BR与AD发病之间有着某种内在的关系。
泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome System,，UPS)是真核细胞ATP依赖的非溶酶体蛋白降解系统。该通路参与真核细胞内多种生物学功能，在维持细胞的正常稳态、调节细胞的生存中起着关键作用。UPS在神经系统中的生理作用早已备受关注，它的功能抑制能导致多种神经系统相关的疾病。文献报道，AD脑组织中蛋白质异常积聚与UPS功能抑制有关，但UPS功能抑制的机理不清。
我们的前期研究证实，BR可以抑制泛素-蛋白酶体系统的活性及功能，这可能是胆红素导致神经元损伤的主要机制，但这是否也构成BR诱导Alzheimer样病变的机制尚不清楚，为了阐述这一问题，我们在原代海马神经元和SD大鼠水平，来探讨BR是否诱导大鼠出现AD样变化及其可能的机制。
第一部分胆红素诱导SD大鼠Alzheimer样病变的研究
目的：在高胆红素血症模型大鼠水平，研究胆红素是否诱导SD大鼠出现AD样病变。
方法：采用新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度BR(0、12、25、50、100μg/g体重)3天，2次/天，复制高胆红素血症模型。分别继续饲养至1月龄和4月龄，检测大鼠学习记忆能力及听力的变化。
结果：
1.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度BR，建立了高胆红素血症模型，继续饲养至1月龄，用Morris水迷宫来检测大鼠的学习记忆能力，结果发现：BR可以损伤1月龄大鼠的学习记忆能力，其中50μg/g、100μg/g剂量组的大鼠与对照组相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
2.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度BR后，继续饲养至4月龄，用Morris水迷宫来检测大鼠的学习记忆能力。因100μg/g剂量组大鼠死亡率高，饲养至四月龄时存活的数量无法构成统计学分析例数，故不纳入此实验测试中。结果发现：胆红素可以损伤4月龄大鼠的学习记忆能力，且各胆红素剂量组的大鼠与对照组相比，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。
3.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度胆红素后，继续饲养至4月龄，进行听力测试。结果发现：随着胆红素浓度的增加，听觉受损的程度加重，其中25、50μg/g剂量组的大鼠听力反应阈值明显高于对照组(p＜0.05)。
结论：胆红素能导致大鼠的学习和记忆能力进行性下降，且能损伤大鼠的听觉功能，以上都符合AD的特征性临床表现，由此推论，胆红素能诱导SD大鼠Alzheimer样病变。
第二部分胆红素诱导SD大鼠Alzheimer样病变的机制的研究
目的：在原代海马神经元、高胆红素血症大鼠模型以及侧脑室注射胆红素的SD大鼠水平，探讨胆红素诱导SD大鼠出现Alzheimer样病变可能的作用机制。
方法：
1.培养3d的海马神经元，用不同浓度的胆红素(DMSO、6、12、25、50、100μmol/L)及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶蛋白表达量的变化；用免疫荧光法检测了K48及Tau蛋白Ser396位点的变化；用SUC-LLVY-AMC检测20S蛋白酶体CT-like酶解活性。
2.采用新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度胆红素(0、25、50、100μg/g体重)3天，2次/天。末次注射12h后，取脑组织用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶、泛素化的蛋白质Ub的蛋白变化；用免疫组化检测脑组织内K48泛素链的聚集情况。
3.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度胆红素(0、12、25、50、100μg/g体重)3天，2次/天。分别继续饲养至1月龄和4月龄，取脑组织进行免疫组化及用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶的变化。
4.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素(0、25、50μmol/L脑脊液)，注射完成24h后，提取大鼠海马脑组织蛋白。Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶、泛素化的蛋白质Ub、K48泛素链的变化。
结果：
1.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素(DMSO、6、12、25μmol/L)及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，提取细胞总蛋白，用Western-blot检测Tau蛋白Ser396位点，结果显示：Tau蛋白在Ser396位点出现过度磷酸化。
2.新生3天的SD大鼠，腹腔连续注射不同浓度胆红素(0、25、50、100μg/g体重)3天，诱导SD大鼠高胆红素血症模型。末次注射24h后，提取海马脑组织蛋白用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点，结果发现Tau蛋白在Tau-1(Ser198/202位点的非磷酸化)、Ser396、Ser262、Ser214、Thr231位点均出现了过度磷酸化。
3.当新生大鼠注射完胆红素后，继续饲养至1月龄和4月龄，提取大鼠海马组织蛋白，Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点。1月龄SD大鼠的Western-blot结果显示：随着胆红素浓度的增加，Tau蛋白在Tau-1、Ser396、Ser262位点均出现了过度磷酸化；4月龄SD大鼠Western-blot结果显示：Tau蛋白在Tau-1、Ser396、Ser262、Thr231位点均出现了过度磷酸化。4月龄大鼠脑组织免疫组化实验结果也显示：胆红素导致Tau蛋白在大鼠海马区的Tau-1、Ser396位点出现过度磷酸化，大鼠皮质区的Ser262位点亦出现过度磷酸化。
4.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素(0、25、50μmol/L脑脊液)。注射完成24h后，提取大鼠海马组织蛋白，用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点，结果显示：随着胆红素浓度的增加，Tau蛋白在Tau-1、Ser396、Ser262、Ser214、Thr231位点均出现了过度磷酸化。
1-4说明胆红素可以导致大鼠脑组织内Tau蛋白多位点的过度磷酸化。
5.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，提取细胞总蛋白，用Western-blot检测与Tau蛋白磷酸化相关的蛋白激酶与蛋白酯酶的变化，发现激酶与酯酶无明显变化。
6.新生3天的SD大鼠，腹腔连续注射不同浓度胆红素3天，取海马脑组织用Western-blot检测与Tau蛋白磷酸化相关的蛋白激酶与蛋白酯酶的变化，结果显示：GSK-3β、Ser9位点的磷酸化水平无明显变化，而Tyr216位点(活性形式)的磷酸化水平随着胆红素浓度增加而增多，MAPK及其磷酸化的MAPK(活性形式)在各组间无差异，JNK、CDK5蛋白水平在各组间无差异，而JNK的磷酸化活性形式、p25/35(CDK5的活性形式)随着胆红素浓度的增加而明显升高。
7.当腹腔注射胆红素后的新生大鼠饲养至1月龄后，大鼠GSK-3β、Tyr216位点的磷酸化水平、PP-2Ac的水平、MAPK及其磷酸化的MAPK(活性形式)各组间未出现明显改变。继续饲养至4月龄时，大鼠GSK-3β、Tyr216位点的磷酸化水平无明显变化；PP-2Ac、MAPK、JNK、CDK5、p25/35均未见明显改变。
8.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素(0、25、50μmol/L脑脊液)。注射完成24h后，提取大鼠海马组织蛋白，Western-blot检测与Tau蛋白磷酸化相关的蛋白激酶与蛋白酯酶的变化，结果显示：GSK-3β、Ser9位点的磷酸化水平无明显变化，而Tyr216位点(活性形式)的磷酸化水平随着胆红素浓度增加而增多，MAPK及其磷酸化的MAPK(活性形式)在各组间无差异，JNK、CDK5蛋白水平在各组间无差异，而JNK的磷酸化活性形式、p25/35(CDK5的活性形式)随着胆红素浓度的增加而明显升高。
5-8说明胆红素能激活新生SD大鼠及侧脑室注射胆红素的SD大鼠海马组织中的GSK-3β、JNK、CDK5，致使它们活性增加，而这种反应属于急性期反应，在1月龄及4月龄的大鼠脑组织内，激酶及其活性形式在各组间均无明显改变。
9.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，提取细胞总蛋白，用SUC-LLVY-AMC检测20S蛋白酶体CT-like酶解活性，结果发现：随着胆红素浓度的增加，CT-like酶解活性降低。说明胆红素可以抑制UPS的活性。
10.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，免疫荧光检测K48多泛素链，结果显示：随着胆红素浓度的升高，K48多泛素链在神经元内的堆积越多。
11.新生3天的SD大鼠，腹腔连续注射不同浓度胆红素3天，提取海马脑组织蛋白，用Western-blot检测泛素化的蛋白质Ub，结果发现：随着胆红素浓度的增加，Ub聚集越多。免疫组化结果显示：随着胆红素浓度的增加，K48多泛素链聚集增多。
12.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素，注射完成24h后，提取大鼠海马脑组织蛋白。Western-blot检测泛素化的蛋白质Ub及K48泛素链的变化，结果发现：随着胆红素浓度的增加，Ub及K48聚集越多。
10-12说明胆红素可以抑制UPS的功能。
结论：
1.胆红素能诱导SD大鼠出现学习记忆能力下降以及听力损伤。
2.胆红素可以激活大鼠脑组织中激酶GSK-3β、JNK、CDK5，导致它们活性增强，引起神经元内Tau蛋白过度磷酸化。
3.胆红素抑制神经元内UPS的活性和功能，因此过度磷酸化的Tau蛋白降解减少而在神经元内聚集，导致神经细胞功能下降。
胆红素(Bilirubin，BR)是血红素的终末代谢产物，具有多种生物活性，能参与体内多种细胞活动。BR有亲脂性，能透过血脑屏障，对神经系统的毒副作用较大，但具体机制尚不清楚。据报道称AD患脑脊液BR水平显著高于正常对照。还有人认为血液中的BR可作为诊断AD发病的生物指标。这些说明BR与AD发病之间有着某种内在的关系。
泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome System,，UPS)是真核细胞ATP依赖的非溶酶体蛋白降解系统。该通路参与真核细胞内多种生物学功能，在维持细胞的正常稳态、调节细胞的生存中起着关键作用。UPS在神经系统中的生理作用早已备受关注，它的功能抑制能导致多种神经系统相关的疾病。文献报道，AD脑组织中蛋白质异常积聚与UPS功能抑制有关，但UPS功能抑制的机理不清。
我们的前期研究证实，BR可以抑制泛素-蛋白酶体系统的活性及功能，这可能是胆红素导致神经元损伤的主要机制，但这是否也构成BR诱导Alzheimer样病变的机制尚不清楚，为了阐述这一问题，我们在原代海马神经元和SD大鼠水平，来探讨BR是否诱导大鼠出现AD样变化及其可能的机制。
第一部分胆红素诱导SD大鼠Alzheimer样病变的研究
目的：在高胆红素血症模型大鼠水平，研究胆红素是否诱导SD大鼠出现AD样病变。
方法：采用新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度BR(0、12、25、50、100μg/g体重)3天，2次/天，复制高胆红素血症模型。分别继续饲养至1月龄和4月龄，检测大鼠学习记忆能力及听力的变化。
结果：
1.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度BR，建立了高胆红素血症模型，继续饲养至1月龄，用Morris水迷宫来检测大鼠的学习记忆能力，结果发现：BR可以损伤1月龄大鼠的学习记忆能力，其中50μg/g、100μg/g剂量组的大鼠与对照组相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
2.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度BR后，继续饲养至4月龄，用Morris水迷宫来检测大鼠的学习记忆能力。因100μg/g剂量组大鼠死亡率高，饲养至四月龄时存活的数量无法构成统计学分析例数，故不纳入此实验测试中。结果发现：胆红素可以损伤4月龄大鼠的学习记忆能力，且各胆红素剂量组的大鼠与对照组相比，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。
3.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度胆红素后，继续饲养至4月龄，进行听力测试。结果发现：随着胆红素浓度的增加，听觉受损的程度加重，其中25、50μg/g剂量组的大鼠听力反应阈值明显高于对照组(p＜0.05)。
结论：胆红素能导致大鼠的学习和记忆能力进行性下降，且能损伤大鼠的听觉功能，以上都符合AD的特征性临床表现，由此推论，胆红素能诱导SD大鼠Alzheimer样病变。
第二部分胆红素诱导SD大鼠Alzheimer样病变的机制的研究
目的：在原代海马神经元、高胆红素血症大鼠模型以及侧脑室注射胆红素的SD大鼠水平，探讨胆红素诱导SD大鼠出现Alzheimer样病变可能的作用机制。
方法：
1.培养3d的海马神经元，用不同浓度的胆红素(DMSO、6、12、25、50、100μmol/L)及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶蛋白表达量的变化；用免疫荧光法检测了K48及Tau蛋白Ser396位点的变化；用SUC-LLVY-AMC检测20S蛋白酶体CT-like酶解活性。
2.采用新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度胆红素(0、25、50、100μg/g体重)3天，2次/天。末次注射12h后，取脑组织用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶、泛素化的蛋白质Ub的蛋白变化；用免疫组化检测脑组织内K48泛素链的聚集情况。
3.新生3天的SD大鼠，腹腔注射不同浓度胆红素(0、12、25、50、100μg/g体重)3天，2次/天。分别继续饲养至1月龄和4月龄，取脑组织进行免疫组化及用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶的变化。
4.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素(0、25、50μmol/L脑脊液)，注射完成24h后，提取大鼠海马脑组织蛋白。Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点、参与Tau蛋白磷酸化的相关激酶和酯酶、泛素化的蛋白质Ub、K48泛素链的变化。
结果：
1.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素(DMSO、6、12、25μmol/L)及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，提取细胞总蛋白，用Western-blot检测Tau蛋白Ser396位点，结果显示：Tau蛋白在Ser396位点出现过度磷酸化。
2.新生3天的SD大鼠，腹腔连续注射不同浓度胆红素(0、25、50、100μg/g体重)3天，诱导SD大鼠高胆红素血症模型。末次注射24h后，提取海马脑组织蛋白用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点，结果发现Tau蛋白在Tau-1(Ser198/202位点的非磷酸化)、Ser396、Ser262、Ser214、Thr231位点均出现了过度磷酸化。
3.当新生大鼠注射完胆红素后，继续饲养至1月龄和4月龄，提取大鼠海马组织蛋白，Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点。1月龄SD大鼠的Western-blot结果显示：随着胆红素浓度的增加，Tau蛋白在Tau-1、Ser396、Ser262位点均出现了过度磷酸化；4月龄SD大鼠Western-blot结果显示：Tau蛋白在Tau-1、Ser396、Ser262、Thr231位点均出现了过度磷酸化。4月龄大鼠脑组织免疫组化实验结果也显示：胆红素导致Tau蛋白在大鼠海马区的Tau-1、Ser396位点出现过度磷酸化，大鼠皮质区的Ser262位点亦出现过度磷酸化。
4.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素(0、25、50μmol/L脑脊液)。注射完成24h后，提取大鼠海马组织蛋白，用Western-blot检测Tau蛋白多个磷酸化位点，结果显示：随着胆红素浓度的增加，Tau蛋白在Tau-1、Ser396、Ser262、Ser214、Thr231位点均出现了过度磷酸化。
1-4说明胆红素可以导致大鼠脑组织内Tau蛋白多位点的过度磷酸化。
5.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，提取细胞总蛋白，用Western-blot检测与Tau蛋白磷酸化相关的蛋白激酶与蛋白酯酶的变化，发现激酶与酯酶无明显变化。
6.新生3天的SD大鼠，腹腔连续注射不同浓度胆红素3天，取海马脑组织用Western-blot检测与Tau蛋白磷酸化相关的蛋白激酶与蛋白酯酶的变化，结果显示：GSK-3β、Ser9位点的磷酸化水平无明显变化，而Tyr216位点(活性形式)的磷酸化水平随着胆红素浓度增加而增多，MAPK及其磷酸化的MAPK(活性形式)在各组间无差异，JNK、CDK5蛋白水平在各组间无差异，而JNK的磷酸化活性形式、p25/35(CDK5的活性形式)随着胆红素浓度的增加而明显升高。
7.当腹腔注射胆红素后的新生大鼠饲养至1月龄后，大鼠GSK-3β、Tyr216位点的磷酸化水平、PP-2Ac的水平、MAPK及其磷酸化的MAPK(活性形式)各组间未出现明显改变。继续饲养至4月龄时，大鼠GSK-3β、Tyr216位点的磷酸化水平无明显变化；PP-2Ac、MAPK、JNK、CDK5、p25/35均未见明显改变。
8.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素(0、25、50μmol/L脑脊液)。注射完成24h后，提取大鼠海马组织蛋白，Western-blot检测与Tau蛋白磷酸化相关的蛋白激酶与蛋白酯酶的变化，结果显示：GSK-3β、Ser9位点的磷酸化水平无明显变化，而Tyr216位点(活性形式)的磷酸化水平随着胆红素浓度增加而增多，MAPK及其磷酸化的MAPK(活性形式)在各组间无差异，JNK、CDK5蛋白水平在各组间无差异，而JNK的磷酸化活性形式、p25/35(CDK5的活性形式)随着胆红素浓度的增加而明显升高。
5-8说明胆红素能激活新生SD大鼠及侧脑室注射胆红素的SD大鼠海马组织中的GSK-3β、JNK、CDK5，致使它们活性增加，而这种反应属于急性期反应，在1月龄及4月龄的大鼠脑组织内，激酶及其活性形式在各组间均无明显改变。
9.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，提取细胞总蛋白，用SUC-LLVY-AMC检测20S蛋白酶体CT-like酶解活性，结果发现：随着胆红素浓度的增加，CT-like酶解活性降低。说明胆红素可以抑制UPS的活性。
10.培养3d的海马神经元用不同浓度的胆红素及蛋白酶体的抑制剂ps341处理24h，免疫荧光检测K48多泛素链，结果显示：随着胆红素浓度的升高，K48多泛素链在神经元内的堆积越多。
11.新生3天的SD大鼠，腹腔连续注射不同浓度胆红素3天，提取海马脑组织蛋白，用Western-blot检测泛素化的蛋白质Ub，结果发现：随着胆红素浓度的增加，Ub聚集越多。免疫组化结果显示：随着胆红素浓度的增加，K48多泛素链聚集增多。
12.正常成年SD大鼠侧脑室单次注射不同浓度胆红素，注射完成24h后，提取大鼠海马脑组织蛋白。Western-blot检测泛素化的蛋白质Ub及K48泛素链的变化，结果发现：随着胆红素浓度的增加，Ub及K48聚集越多。
10-12说明胆红素可以抑制UPS的功能。
结论：
1.胆红素能诱导SD大鼠出现学习记忆能力下降以及听力损伤。
2.胆红素可以激活大鼠脑组织中激酶GSK-3β、JNK、CDK5，导致它们活性增强，引起神经元内Tau蛋白过度磷酸化。
3.胆红素抑制神经元内UPS的活性和功能，因此过度磷酸化的Tau蛋白降解减少而在神经元内聚集，导致神经细胞功能下降。