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目的:糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）即一种慢性肾病,是糖尿病严重的并发症之一,往往导致终末期慢性肾病。糖尿病是一种代谢性疾病,主要的特征是血糖升高,主要原因是胰岛素的不足或胰岛素抵抗,进而已经威胁到全世界人口的健康。我们国家的糖尿病发病率已经达到了11.6%,然而糖尿病已然成为了我国慢性肾脏病的第二大基础疾病。糖尿病肾病是糖尿病患者常见并发症之一,整个世界范围内有大约30%左右的终末期肾病患者患有糖尿病。总的来说,糖尿病肾病包括与糖尿病有关的诸多肾脏疾病如糖尿病肾小球硬化、肾盂肾炎等等。然而从狭义上来说,糖尿病伴随的肾病发生仅仅是指糖尿病性肾小球硬化,然而糖尿病性肾小球硬化实际上是糖尿病微血管的病变,也是糖尿病并发症里常见的一种。发育及DNA损伤反应调节基因1（regulated in development and DNA damage response 1,REDD1）,又称为RTP801/Dig2/DDIT4,是一种由缺氧和多种DNA损伤刺激诱导的基因,在人体组织中广泛表达。研究证实,多种应激（包括缺氧、氧化应激、内质网应激、DNA损伤和能量应激等）均能够引起细胞中REDD1表达上调。有研究表明,在糖尿病其他模型中,REDD1通过促进糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β,GSK3β）的激活,可降低核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor2,Nrf2）对糖尿病的抗氧化反应。Nrf2信号通路已成为肾脏多种疾病的研究热点,Nrf2作为抑制氧化应激的关键因子,参与肾脏疾病的病理生理的发生发展过程,且大量实验证实Nrf2信号通路对肾脏系统疾病具有保护作用。在本研究中,我们利用体外培养的小鼠足细胞为研究对象,来研究REDD1是否以及如何通过调控GSK3β/Nrf2参与糖尿病肾病发病过程,研究REDD1在糖尿病肾脏的表达情况和亚细胞定位以及REDD1与糖尿病肾脏足细胞损伤的关系及相关分子机制,研究REDD1基因敲低对糖尿病动物肾脏损伤的作用,为阐明糖尿病肾病发病机制以及寻找糖尿病肾病治疗的新靶点提供科学依据,为糖尿病肾病的治疗提供新的思路。方法:1.Western blot、RT-q PCR及免疫荧光检测高糖对体外培养的小鼠足细胞中REDD1的表达以体外培养的小鼠足细胞（MPCs）为研究对象,利用DMEM/F12的培养基并在5%CO2、37℃环境的培养箱里培养细胞,随机分为以下几组:30 mmol/L的高糖刺激0小时组、30 mmol/L的高糖刺激6小时组、30mmol/L的高糖刺激12小时组、30 mmol/L的高糖刺激24小时组、30mmol/L的高糖刺激48小时组、30 mmol/L的高糖刺激72小时组,高糖分别刺激0、6、12、24、48、72小时收集细胞。Western blot、免疫荧光技术检测REDD1蛋白的表达以及定位。Real-time PCR检测REDD1m RNA情况。2.Western blot、RT-q PCR及免疫荧光等方法检测敲低REDD1对GSK3β、Nrf2以及足细胞氧化应激和凋亡的影响将体外培养的小鼠足细胞随机分为以下几组:正常糖组（5.6 mmol/L glucose,NG）、甘露醇组（24.4 mmol/L glucose,M）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）、高糖转染对照组（HG+control sh RNA,HG+C）、高糖质粒敲低组（HG+REDD1 sh RNA,HG+sh RNA）。细胞融合80%时分别用转染试剂Lipofectamine 3000转染空载质粒对照组与REDD1敲低质粒组,孵育6-8小时后,加入30 m M高糖刺激,48 h后收集细胞。Real-time q PCR检测REDD1、Nox4、Synaptopodin、Nephrin m RNA的表达情况,Western blot和免疫荧光技术检测REDD1、Nox4、Synaptopodin、Nephrin、GSK3β、Nrf2、Cleaved caspase 3蛋白表达水平和定位情况,TUNEL、JC-1检测凋亡水平,Mito tracker观察线粒体的形态。3.Western blot和免疫荧光等方法检测GSK3β抑制剂Li Cl对Nrf2以及足细胞氧化应激和凋亡的影响将体外培养的小鼠足细胞随机分为以下几组:正常糖组（5.6 mmol/L glucose,NG）、甘露醇组（24.4 mmol/L glucose,M）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）、高糖+GSK3β的抑制剂组（HG+Li Cl）,于48h后收集细胞。Western blot检测GSK3β、p-GSK3β、Nrf2、Nephrin、Bcl-2、Bax的表达,免疫荧光检测GSK3β的表达量,JC-1检测细胞凋亡水平,Mito tracker观察线粒体的形态。结果:1.REDD1在高糖诱导的小鼠足细胞的表达Western blot结果表明:在不同时间点的高糖刺激小鼠足细胞中,与正常糖相比,REDD1的蛋白表达水平随时间梯度逐渐增多,其中高糖培养MPCs细胞48h时,REDD1的蛋白表达水平最为显著。RT-q PCR结果表明:随高糖刺激小鼠足细胞的时间不断增加,与正常糖组相比,REDD1的m RNA表达不断增多,其中高糖刺激48h时m RNA表达最为明显;2.REDD1通过GSK3β/Nrf2调节足细胞氧化应激和凋亡1)敲低REDD1对Nephrin、Synaptopdin的影响Western blot结果表明:高糖刺激48h后,与正常糖组相比,高糖情况下MPCs中Synaptopodin和Nephrin的蛋白表达水平明显减少。与空载质粒组相比,质粒敲低组的Synaptopodin、Nephrin的蛋白表达水平均有所升高。免疫荧光结果进一步证明:在体外培养的小鼠足细胞中敲低REDD1基因,nephrin的荧光表达强度均有所升高。2)敲低REDD1对凋亡的影响Western blot结果表明:高糖刺激48h后,与正常糖组相比,高糖情况下MPCs中Cleaved caspase 3蛋白表达水平明显升高,与空载质粒组相比,高糖情况下质粒敲低组的蛋白表达水平均明显降低。TUNEL结果显示:与正常糖组相比,高糖情况下凋亡细胞明显增多,敲低REDD1后发现凋亡的细胞减少。3)敲低REDD1对足细胞氧化应激的影响高糖刺激48 h后,与正常糖组相比,高糖情况下MPCs中Nox4蛋白表达水平明显升高。与空载质粒组相比,质粒敲低组的Nox4蛋白表达水平均明显降低。免疫荧光结果进一步证明:在体外培养的小鼠足细胞中敲低REDD1基因,Nox4荧光表达强度均明显降低。RT-q PCR的结果表明:在体外培养的小鼠足细胞中敲低REDD1基因,Nox4的m RNA水平均明显降低。4)敲低REDD1对线粒体形态与膜电位的影响JC-1荧光探针显示:正常糖组红色荧光明显多于绿色荧光,与正常糖组相比,高糖组绿色荧光明显增强,表示线粒体膜电位显著降低,REDD1敲低组红色荧光有所缓解,可恢复部分线粒体膜电位水平。通过共聚焦显微镜进行Mito tracker染色可观察到:正常糖组线粒体形态呈现丝状、短棒状,结构完整且规则清晰,高糖情况下线粒体杂乱不规则、结构破裂且肿胀。与高糖情况下相比,敲低REDD1组线粒体形态相对规则,结构相对完整。5)敲低REDD1对GSK3β、p-GSK3β、Nrf2的影响Western blot结果表明:高糖刺激48h后,与正常糖组相比,高糖情况下MPCs中GSK3β蛋白表达水平明显升高,p-GSK3β蛋白表达水平均明显降低。与空载质粒组相比,高糖情况下质粒敲低组的GSK3β表达水平明显降低,p-GSK3β表达水平明显升高。免疫荧光结果进一步证明:在体外培养的小鼠足细胞中敲低REDD1基因,GSK3β荧光表达强度均明显降低,p-GSK3β的荧光表达强度均有所升高。3.Western blot和免疫荧光等方法检测GSK3β抑制剂对Nrf2以及足细胞氧化损伤和凋亡的影响1)加入GSK3β抑制剂对Nephrin的影响Western blot结果表明:高糖刺激48h后,与正常糖组相比,高糖情况下MPCs中Nephrin蛋白表达水平明显降低,加入GSK3β的抑制剂组的蛋白表达水平均明显升高。2)加入GSK3β抑制剂对线粒体形态和膜电位的影响JC-1荧光探针显示:正常糖组红色荧光明显多于绿色荧光,与正常糖组相比,高糖组绿色荧光明显增强,表示线粒体膜电位显著降低,加入GSK3β抑制剂组红色荧光有所缓解,可恢复部分线粒体膜电位水平。通过共聚焦显微镜进行Mito tracker染色可观察到:正常糖组线粒体形态呈现丝状、短棒状,结构完整且规则清晰,高糖情况下线粒体杂乱不规则、结构破裂且肿胀。与高糖情况下相比,加入GSK3β抑制剂组线粒体形态相对规则,结构相对完整。3)加入GSK3β抑制剂对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的影响Western blot结果表明:高糖刺激48h后,与正常糖组相比,高糖情况下MPCs中Bax蛋白表达水平明显升高,加入GSK3β的抑制剂组的蛋白表达水平均明显降低。与正常糖组相比,高糖情况下MPCs中Bcl-2蛋白表达水平明显降低,加入GSK3β的抑制剂组的蛋白表达水平均明显升高。4)加入GSK3β抑制剂对GSK3β、p-GSK3β、Nrf2的影响Western blot及免疫荧光显示:加入GSK3β的抑制剂后GSK3β的表达有所降低,从而验证抑制剂起了一定的作用。Western blot结果表明:高糖刺激48h后,与正常糖组相比,发现Nrf2与p-GSK3β的表达均有所降低,加入GSK3β的抑制剂后Nrf2与p-GSK3β的表达均有所升高。结论:1.在体外培养的小鼠足细胞中,高糖情况下会促进REDD1的表达。2.在糖尿病肾病中REDD1表达上调,并通过激活GSK3β/Nrf2信号通路参与足细胞氧化损伤与凋亡。