背景:目前整形美容外科医师正在寻找理想的组织填充材料来治疗凹陷和填充皱纹。合成或异体的填充物因免疫排斥或吸收等问题临床应用受到限制,注射培养的自体真皮成纤维细胞作为一种活的、动态的蛋白修复系统进行真皮和皮下组织缺损的修复具有良好的临床应用前景,但目前,国内外学者对成纤维细胞注射移植后存活情况的深入研究不多。目的:研究和建立较为理想的小鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养、鉴定及注射移植的技术方法。通过双光子显微镜观察体外培养的成纤维细胞皮内注射移植后的长期存活情况,了解胶原纤维等基质成分的变化,为临床应用自体真皮成纤维细胞进行软组织填充的可行性提供可靠的理论基础。方法:用组织块法对每只小鼠皮肤成纤维细胞进行原代培养,消化加反复贴壁法纯化细胞。倒置相差显微镜下观察细胞的形态学特征,并作波形蛋白(vimentin )抗体免疫细胞化学染色及染色体分析。生产EGFP慢病毒液,并用其转染培养的成纤维细胞,倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。将转染成功的细胞注射移植到相应来源的小鼠皮内,生理盐水作阴性对照。分别于注射1个月、2个月后取材,标本行连续冰冻切片,用双光子显微镜观察细胞及胶原的变化,对胶原的分布面积比值和真皮厚度作图象分析,并对所得数据进行统计分析处理。结果:1.倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形或不规则三角形、放射状或漩涡状走行。免疫细胞化学染色结果显示波形蛋白呈阳性,染色体分析结果表明细胞具有正常的染色体数目(2n=40)。2.观察发现EGFP慢病毒液感染成纤维细胞的效率在80%以上,感染后成纤维细胞仍呈长梭形,按常规方法传代后细胞的荧光强度无减弱。3.应用双光子显微镜观察发现实验组注射移植细胞体积较大,胶原排列紊乱;与HE染色观察结果一致。经图象分析及统计处理发现:1个月时,胶原分布面积及真皮厚度变化无统计学意义(P>0.05);2个月后胶原分布面积及真皮厚度均较对照组明显增加(P<0.05)。结论:1.组织块培养法简便、经济,该法所获得的成纤维细胞可在体外稳定培养,为皮内注射移植提供了充足、可靠的细胞来源。2.慢病毒载体可以高效稳定地转染真皮成纤维细胞,对细胞损害小,是较为理想的基因转移载体。3.体外分离培养的自体真皮成纤维细胞注射移植到皮内可在较长时间内存活,能够分泌胶原并增加真皮厚度,起到较为持久的填充作用,为临床应用自体成纤维细胞填充细小凹陷提供了理论依据。