非洲菊和彩叶芋抗病基因同源序列的分离鉴定和抗白粉病分子标记

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NB-LRR类抗病基因是植物抗病基因中分布最广和数量最大的一类基因家族,该类抗病基因产物具有高度保守结构域。抗病基因类似序列(RGCs)就是根据不同物种抗病基因高度保守的NB区域设计兼并引物并通过PCR扩增的方法获得。非洲菊和彩叶芋作为国内外重要的观赏植物深受人们的喜爱,具有重要的经济价值。彩叶芋品种的发展改良具有悠久的历史,然而彩叶芋品种的数量却在逐年减少,导致彩叶芋遗传多样性的丧失,遗传多样性的减少很可能会使植株更易感染新的病虫害。RGCs序列的克隆可以更好的了解植物遗传多样性、基因组的分布、抗病基因的分子演化、开发分子标记,加速植物抗病育种的进程。由Podosphaera fusca引起的白粉病是非洲菊上危害最严重的病害之一,该病害能侵染植物的叶、茎和花,严重影响植物的生长,降低花朵的质量。本实验首次对非洲菊和彩叶芋RGCs序列进行分离克隆,开发了非洲菊分子标记,分析了彩叶芋品种的遗传多样性。创建了非洲菊后代分离群体,对非洲菊抗白粉病进行了遗传分析、QTL定位和细胞学观察。主要研究结果如下:非洲菊RGCs序列分离克隆中,共选用34个抗病基因简并引物,以抗白粉病品系UFGE7011,品种Funtastic ‘Blush’和‘Jaguar Red’为材料,应用PCR方法,共获得84个非洲菊RGCs序列。选择19个有代表性的GhRGCs(氨基酸同源性≤90%),其氨基酸序列具有P-loop、RNBS-A-TIR(RNBS-A-nonTIR)、Kinase-2、RNBS-B、RNBS-C和GLPL保守区域,分为了toll and interleukin receptor-NB-LRR(TNL)和coiled coil-NB-LRR(CNL)两种类型,9个亚家族,其氨基酸序列的同源性为15-50%。选取15个非洲菊RGCs序列设计引物,以非洲菊高抗白粉病品种UFGE4033和高感品种‘Sunburst Snow White’为材料,共开发1个SCAR标记,11个CAPS标记和242个TRAP标记。TRAP标记中,每对特异引物可平均扩增出28.5个DNA片段(50-700bp),平均有1.8个DNA条带在UFGE4033和‘Sunburst Snow White’中有多态性。这有多态性的DNA条带将用于非洲菊抗白粉病分子标记。彩叶芋RGCs序列分离克隆中,选用14个抗病基因简并引物,以4个彩叶芋编号为C12,C90,C95,C97的品种为材料,应用PCR方法,共获得71个彩叶芋RGCs序列。选取18个有代表性的CRGCs(氨基酸同源性≤90%),其氨基酸序列具有P-loop、RNBS-A-TIR、Kinase-2、RNBS-B、RNBS-C和GLPL保守区域,分为CNL类型,8个亚家族,其氨基酸序列的同源性为22-54%。利用TRAP技术,对彩叶芋8个品种进行遗传多样性分析。共扩增出260条清晰可数的DNA条带,多态性条带数为92条,多态性位点百分率25.1%,两两间的杰卡德相似系数分布范围为0.281-0.731。利用NTsys2.10e软件SAHN程序和UPGMA方法进行聚类分析,获得了8个彩叶芋品种的聚类图,将供试材料分为两个主要类群。这些结果有助于有目的的选择和保存彩叶芋遗传种质资源,减缓多样性的丧失。UFGE31-19是从2,000+个非洲菊品系中筛选出来的抗病品种,UFGE4033是UFGE31-19与高感白粉病品种UFGE35-4杂交后代选育出来的抗白粉病品种。为了研究UFGE4033和UFGE31-19对白粉病的遗传特征,创建了UFGE4033与‘SunburstSnow White’杂交的回交群体‘7-4’和‘7-157’,用于非洲菊抗白粉病遗传分析和分子标记。历时近15个月的群体抗白粉病调查结果显示,自然发病条件下,群体单株的严重度呈连续分布,分别有两个峰值,说明非洲菊UFGE4033和UFGE31-19对白粉病抗性属于数量性状遗传,可能存在主效抗白粉病基因。共选用648对引物,包括15对非洲菊RGCs序列、99对EST-SSR序列、518对TRAP引物,在抗病亲本、感病亲本、PM-R池和PM-S池中共鉴定出17个多态性片段,其中有11个引物组合属于同一个连锁群,检测到2个与非洲菊抗白粉病相关的QTLs,共有71.1%的表型变异。组织学观察表明,P. fusca在UFGE4033和‘Sunburst Snow White’上分生孢子的萌发、附着胞的产生和次生菌丝的形成均没有明显差异。P. fusca在不同侵染类型植株上的差异在于菌丝的分支数目、菌丝的线性长度、单菌落产孢量。
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