角质层蜡质是覆盖于陆生植物暴露于地面部分的脂类结构疏水层,为植物与外界环境之间的保护性障碍物,在植物抵抗各种生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用,如防止水分胁迫时植物过度脱水、抵抗病虫害入侵、抵抗霜冻等。另外,角质层蜡质在介导花粉-柱头之间的信号识别以及影响花粉育性方面也发挥着重要作用。　　 植物蜡质的生物合成研究已经取得很大进展,很多蜡质突变体的基因已经被克隆,但一些基因在蜡质合成的生物化学途径中的作用尚不确切。而且,对于蜡质合成相关基因的功能研究主要集中在拟南芥和玉米中,水稻中的相关研究报道较少。本研究采用RT-PCR和GUS染色以及亚细胞定位等方法对两个蜡质合成相关基因OsCER4和OsGL3的生物学特性进行了研究;通过反义RNA技术获得了表达量下调的转化植株,从表达量下调的转化植物的表型、生理和蜡质成分变化等方面,以及结合其生物学特性推测蜡质合成相关基因OsCER4和OsGL3的功能,并对逆境处理下水稻蜡质合成相关基因表达以及叶表面蜡质的积累进行了研究,主要结果如下:　　 1.水稻蜡质合成相关基因OsCER4生物学特性和功能研究　　 生物信息学分析表明,OsCER4位于水稻基因组的第2染色体上,包括9个外显子和8个内含子,cDNA数据库中的序列号为NM 001055025,全长为2219 bp,ORF为1908 bp,编码635 aa的蛋白,分子量为71.6 kD。OsCER4与位于第10染色体的水稻蜡质合成相关基因Wda1和拟南芥CER1同源性较高。蛋白保守区域分析表明,其属于脂肪酸羟化酶超家族成员。　　 RT-PCR和GUS染色分析表明,OsCER4在愈伤组织、根、茎、不同时期的叶、早期穗子的枝梗以及晚期穗子的颖壳等组织表达,表达部位集中于微管束组织。　　 构建了由OsCER4的全长ORF序列与eGFP基因融合的瞬时表达载体,并转化水稻叶肉细胞原生质体进行亚细胞定位分析,结果表明,OsCER4定位于过氧化物酶体中。　　 构建了由OsCER4自身启动子驱动的反义RNA载体,采用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11愈伤组织获得转化植株,以Southem杂交和Western分析筛选获得了表达量下调的转化植株,对转化植物的表型、生理变化、蜡质总量和成分变化以及抗旱性等方面进行了观察和研究。OsCER4反义RNA转化植株表现为抽穗期叶下垂,叶表面光滑,籽粒变小,种子直链淀粉含量增加;电镜扫描分析表明,反义RNA转化植株叶表面蜡质覆盖量大大减少,以热氯仿抽提蜡质测定蜡质总量表明,其蜡质总量大大减少,GC-MS分析表明,蜡质组分脂肪酸和一级醇严重减少;叶绿素浸提和失水性试验表明,反义RNA转化植株叶蜡质表皮渗透性增加;植株幼苗干旱处理结果表明,反义RNA转化植株幼苗对干旱胁迫敏感。　　 2.水稻蜡质合成相关基因OsGL3生物学特征和功能研究　　 生物信息学分析表明,OsGL3位于水稻基因组的第6染色体上,包括10个外显子和9个内含子,cDNA数据库中的序列号为NM 001064772,全长为2233 bp,ORF为1884 bp,编码一个含627 aa的蛋白,分子量为70.96 kD。OsGL3与位于第9染色体的水稻蜡质合成相关基因GL1-2以及玉米GL1和拟南芥WAX2同源性较高。蛋白保守区域分析表明,其属于脂肪酸羟化酶超家族成员。　　 RT-PCR和GUS染色分析表明,OsGL3在花药、颖壳和愈伤组织中表达,营养器官中表达量低或不表达。　　 构建了由OsGL3的全长ORF序列与eGFP基因融合的瞬时表达载体,并转化水稻叶肉细胞原生质体进行亚细胞定位,结果表明,OsGL3定位于内质网和质膜中。　　 构建了由OsGL3自身启动子驱动的反义RNA载体,采用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11愈伤组织获得阳性植株。以Southern杂交和RT-PCR方法筛选获得了表达量下调的转化植株,并对反义RNA转化植物的表型、生理和蜡质组成成分变化等方面进行了研究。OsGL3反义RNA转化植株表现为花药干瘪、短小、花粉不开裂、花粉育性降低和结实率下降;扫描电镜分析表明,花药短小,花药壁细胞长度缩短,花药壁、花粉粒、颖壳以及叶表面蜡质覆盖量减少;叶绿素浸提和失水性试验表明,转化植株叶表皮蜡质渗透性增加;花药蜡质成分GC-MS定性和定量分析表明,反义RNA转化植株花药的总蜡质含量下降了21.1％。其中烷烃下降了16.8％,豆甾醇下降了41.2％,而一级醇增加了75％;颖壳蜡质成分GC-MS定性和定量分析表明,反义RNA转化植株的颖壳总蜡质与对照植株的总蜡质含量相差不大,但脂肪酸含量下降了31％,一级醇含量上升了27.8％,酯的含量增加了75.8％。　　 3.逆境处理对水稻蜡质合成相关基因表达和表面蜡质积累的影响研究　　 分别以200 mmol/L NaCl、12％PEG、1.0％H2O2、40℃高温和8℃低温对水稻中花11幼苗进行处理,对蜡质合成相关基因OsCER4和OsGL3的表达情况进行了分析,并对逆境处理下幼苗叶表面蜡质的积累进行了研究。RT-PCR分析结果表明,蜡质合成相关基因OsCER4和OsGL3可被逆境处理诱导表达,但其表达诱导与逆境处理因素以及时间有关;叶表面蜡质总量测定以及电镜扫描结果表明,12％PEG、1.0％H2O2和8℃低温处理可明显增加水稻幼苗叶表面蜡质的积累,而200 mmol/L NaCl和40℃高温处理对叶表面蜡质覆盖量影响不大。