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第一部分:褪黑素对糖皮质激素诱导的大鼠股骨头坏死的影响目的:本部分利用甲强龙(Methylprednisolone,MP)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立大鼠股骨头坏死模型,观察褪黑素对糖皮质激素诱导的大鼠股骨头坏死的影响。方法:(1)建立以MP和LPS诱导的Sprague-Dawley(SD)大鼠股骨头坏死模型,同时给予褪黑素(Melatonin,MT)干预治疗,建模6周之后处死所有实验大鼠,取出各组大鼠双侧股骨头进行Micro-CT扫描和相关参数的分析。(2)将股骨头标本制作成切片,通过苏木素-伊红(Hematoxylin eosin,HE)染色观察各实验组中大鼠股骨头组织形态学的改变。(3)将股骨头标本制作成切片,通过免疫组织化学染色(Histological and immunohistochemical staining)观察各实验组大鼠股骨头组织中成骨相关因子表达的变化。结果:(1)Micro-CT二维重建结果显示,对照组中的大鼠未见明显股骨头坏死发生;模型组中4/5只的大鼠出现不同程度的股骨头坏死;而在治疗组中,仅有1只大鼠发生了单侧股骨头坏死。此外,模型组中大鼠股骨头区域骨量减少,骨小梁稀疏,股骨头负重区形态不规则;而治疗组中大鼠股骨头区域骨量显著增加,股骨头形态较规则;相关指标定量分析显示骨密度(BMD)、骨体积(BV)、骨体积/总体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)结果与二维重建结果相对应。(2)HE染色结果可见模型组中大鼠股骨头区域正常骨小梁结构消失,其中有大量脂肪细胞填充;而治疗组中大鼠股骨头骨小梁结构存在,仅有少量脂肪细胞。(3)免疫组织化学染色结果显示,相比于对照组,模型组的大鼠股骨头区域骨小梁中锌指结构转录因子Sp7(Osterix)、Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)和Runt相关转录因子2(Runx2)表达均降低;而予以MT治疗后上述成骨相关因子表达上调。结论:褪黑素提高了大鼠成骨能力,从而有效地缓解了糖皮质激素诱导的大鼠股骨头坏死。第二部分:褪黑素对糖皮质激素干预条件下骨髓间充质干细胞氧化应激和成骨分化的影响目的:本部分探究褪黑素对糖皮质激素处理后的骨髓间充质干细胞氧化应激和成骨分化的影响。方法:(1)用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)检测不同浓度MP(0M、10-5M、10-4M、10-3M)在不同时间条件下(24h、48h和72h)对骨髓间充质干细胞增殖毒性影响。(2)用不同浓度的MP(0M、10-5M、10-4M、10-3M)干预骨髓间充质干细胞24小时,活性氧(ROS)检测试剂盒检测各组细胞中ROS的含量;蛋白免疫印迹实验(Western Blot)检测各组细胞中氧化相关蛋白的表达情况;成骨诱导7天后进行碱性磷酸酶(ALP)染色及活性检测;Western Blot检测各组细胞中成骨相关蛋白的表达情况;成骨诱导14天后进行茜素红(ARS)染色比较成骨分化影响。(3)联合不同浓度的MT(10μM,100μM),对经MP处理的骨髓间充质干细胞培养干预24小时,ROS检测试剂盒检测各组细胞中ROS的含量,Western Blot方法检测各组细胞中氧化相关蛋白表达情况;成骨诱导7天后进行ALP染色及活性检测;Western Blot检测各组细胞中成骨相关蛋白的表达情况;成骨诱导14天后进行茜素红染色比较成骨分化影响。结果:(1)CCK-8结果显示在24h时浓度为10-4M的MP对骨髓间充质干细胞的增殖毒性的作用较小。(2)不同浓度的MP使骨髓间充质干细胞内活性氧(ROS)含量不同程度的增多,尤其浓度在10-4M和10-3M;同时MP也下调了细胞中抗氧化蛋白和成骨分化蛋白的表达,抑制了细胞成骨分化和矿化。(3)褪黑素减少了 MP诱导的细胞内ROS的含量,减轻了细胞氧化应激损伤,提高了骨髓间充质干细胞成骨分化和矿化能力。结论:褪黑素能减轻MP诱导的骨髓间充质干细胞氧化应激损伤,提高细胞的成骨分化能力。第三部分:褪黑素通过MT2/PI3K/AKT通路调控糖皮质激素干预条件下BMSCs氧化应激和成骨分化目的:本部分探究褪黑素是否通过MT2介导调控PI3K/AKT通路,并进一步研究PI3K/AKT通路的激活对MP诱导的骨髓间充质干细胞氧化应激损伤和成骨分化障碍的影响。方法:(1)利用Luzindole(MT受体抑制剂)对MT2进行阻断,Western Blot检测比较各组中PI3K/AKT通路相关因子和各组氧化应激以及成骨分化相关指标表达变化;成骨诱导7天后进行ALP染色及活性检测;成骨诱导14天后进行茜素红染色比较成骨分化影响。(2)用Wortmannin(PI3K/AKT通路抑制剂)阻断PI3K/AKT通路后,Western Blot检测比较各组中氧化应激和成骨相关蛋白表达变化情况。结果:(1)MT2介导褪黑素对骨髓间充质干细胞抗氧化应激作用和提高成骨分化能力,增加了 PI3K/AKT通路相关因子的表达。(2)褪黑素激活了 PI3K/AKT信号通路,增强了骨髓间充质干细胞抗氧化能力,促进了细胞成骨分化。结论:褪黑素可通过MT2介导激活PI3K/AKT通路,降低骨髓间充质干细胞氧化应激损伤,促进细胞成骨分化。