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内源性抗菌肽是天然免疫的重要介质,是炎症反应起保护作用的重要分子基础。寻找新的抗菌肽分子一直是科学家梦寐以求的愿望。高迁移率组蛋白N2(High Mobility Group Chromosal protein N2,HMGN2)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中普遍存在的非组蛋白,目前对其功能还不完全清楚。在本实验室从人LAK细胞和人宫颈黏液中分离纯化寻找抗菌肽过程中,发现HMGN2具有较强的抗革兰氏阴性菌的作用,为进一步证实其参予机体天然免疫的可能性,及其可能机制,本文重点研究其在细胞内的定位及利用其α螺旋结构域较强的跨膜能力及肿瘤导向力,构建重组免疫毒素,以期用于肿瘤的靶向治疗。 本文分三个部分。 第一部分是从本室已构建的pGEX-1λT-HMGN2大肠杆菌表达载体经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导高效表达出GST-HMGN2融合蛋白,进一步用GST亲合层析柱分离纯化得到较纯的GST-HMGN2融合蛋白,免疫新西兰兔,成功制备出较高效价的HMGN2特异多克隆抗体,初步用于THP-1细胞中HMGN2的亚细胞定位分析,发现在LPS刺激下,免疫细胞化学染色显示HMGN2不仅分布于单核吞噬细胞核,还分布于细胞浆,并且ELISA法也显示可释放到细胞外。 第二部分为进行HMGN2的亚细胞定位分析,提取人LAK细胞总RNA,设计合成相应引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HMGN2 cDNA,以pcDNA3.1-myc-his和pEGFP-N1为载体,成功构建出HMGN2真核表达载体,转染Hela细胞,转染效率达70%~80%,用抗六组氨酸臂的单克隆抗体经免疫细胞化学染色显示经pcDNA3.1-myc-his-HMGN2转染的Hela细胞除细胞核外,胞浆亦明显着色,未转染的Hela细胞无论细胞核还是细胞浆均显阴性;用兔抗人HMGN2多克隆抗体进行的免疫细胞化学染色显示转染的Hela细胞与用抗六组氨酸臂的单克隆抗体检测结果相同,而未转染的Hela细胞核内和胞浆也均有