乳腺癌是临床上女性最为常见的恶性肿瘤之一,在现今世界恶性肿瘤发生率中排名第三位,同时也是女性最常见的恶性肿瘤和引起女性相关死亡的主要肿瘤病因。相关统计显示,乳腺癌的发病率正呈现出逐年增多的趋势。对乳腺癌的不断研究及乳腺癌治疗方法的进步,乳腺癌的治疗效果有了一定的改善。世界卫生组织根据乳腺癌组织学特征,蛋白免疫组化表达特征,基因型特征及临床治疗靶点等因素,将乳腺癌分为不同的分子亚型。其中luminal型(包括A和B)是乳腺癌的最主要类型,占乳腺癌患者比例70%左右,预后最差的为三阴性乳腺癌。Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是生物免疫反应中一个重要的模式识别受体,它能识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)及内源性配体,从而激活免疫系统和炎性介质的释放,引发适当的免疫反应。Toll样受体除了在免疫细胞和肿瘤细胞中调高的表达外,Toll样受体在部分组织的正常上皮细胞也有表达,比如胃、肺泡的上皮细胞等。新进的研究表明,Toll样受体在多种肿瘤细胞中有表达,并且发现Toll样受体的高表达与恶性肿瘤的不良预后有关。我们在TCGA数据库中筛查到TLR4在乳腺癌随访死亡病例中显著高表达,这提示TLR4是乳腺癌中关键的预后指标。同时TLR4在luminal型(包括A和B)是乳腺癌和三阴性乳腺癌这两个亚群中也与预后显著相关。为了进一步分析TLR4在乳腺癌中的作用机制,我们体外分选了TLR4阳性的乳腺癌细胞(luminal型乳腺癌细胞系MCF-7,三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231),结果显示TLR4阳性MCF-7细胞和乳腺癌细胞干性密切相关,而TLR4阳性MDA-MB-231细胞则有很强EMT特征。同时我们还检测了TLR4内源性配体HMGB1在乳腺癌组织中的表达,以期通过HMGB1和TLR4的联合检测分析,为乳腺癌诊疗提出新的检测指标和治疗方案。ASCL2(Achaet scute-like 2,ASCL2)是一个和肿瘤发生发展相关的转录因子,已被证明在肿瘤组织中高表达,能够促进肿瘤的增殖和侵袭,和肿瘤患者的预后差有密切的关联。近期研究表明,ASCL2既可以受WNT信号通路的调节,也可以和趋化因子受体(Chemokine receptor 4,CXCR4)结合来促进癌细胞的侵袭和转移,并提示ASCL2与结肠癌干细胞的―干性‖有明显的相关性。ASCL2在乳腺癌中的表达与乳腺癌临床病理学之间的研究尚未开展。我们收集了191例在第三军医大学西南医院手术切除的女性乳腺癌标本。首先检测了ASCL2在临床乳腺癌标本中的表达,并结合乳腺癌患者临床病理特征进行统计学分析,验证ASCL2表达和患者临床特征及预后的关系。通过ASCL2和TLR4在乳腺癌组织表达的分析,试图发现TLR4和ASCL2之间的关联关系,为乳腺癌干性调控提供新的思路。随着基因检测技术的不断发展和基因组学研究的逐渐深入,和乳腺癌相关的基因不断被发现。检测患者乳腺癌相关基因的扩增、突变和表达异常情况,对早期诊断、预后判断以及治疗方案决策等具有重要意义,BRCA1,BRCA2等基因已被证明和乳腺癌的易感性相关。Yang等已经发现乳腺癌组织TLR4基因的多态性和乳腺癌的预后有明显的关联性。我们通过收集24位乳腺癌患者的血样,在germline水平上对TLR4基因的多态性进行检测,研究分析其与乳腺癌易感性的关系。主要结果和结论如下:1.乳腺癌死亡病例的TLR4表达显著增强,并与乳腺癌干性指标ALDH1A1显著相关(1)TCGA数据库分析结果显示:乳腺癌死亡组(death)与无病生存组(DFS),两组TLR4表达值(平均值)分别为:0.5131和0.0163,统计学分析t=3.441 df=258,P值为0.0007,两组间有极显著差异;(2)TCGA数据库分析luminal型乳腺癌中TLR4在死亡组(death)和无病生存组(DFS)表达有显著差异(P<0.05);(3)数据库分析三阴性乳腺癌中TLR4在死亡组(death)和无病生存组(DFS)表达有显著差异(P<0.05);(4)进一步分析显示:luminal型乳腺癌死亡病例的TLR4表达与ALDH1A1表达的相关性的r2值为0.8316(P<0.0001);三阴性乳腺癌死亡病例的TLR4表达与ALDH1A1表达的相关性的r2值为0.478(P<0.0001)。2.TLR4阳性的乳腺癌细胞具有干性特征(1)流式分选TLR4+MCF-7细胞(luminal型),进行ALDH1的检测,结果示:TLR4阳性的MCF-7细胞中,ALDH1阳性细胞比例高达76.0%;TLR4阴性MCF-7细胞中,ALDH1阳性细胞比例为2.30%;(2)检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231(三阴性乳腺癌),TLR4阳性细胞比例占ALDH1的69.4%;(3)分选的TLR4阳性的乳腺癌细胞MCF-7的干性转录因子OCT4、SOX2、Nanog的表达显著增高,并且成球能力显著增强;(4)TLR4阳性的MDA-MB-231的EMT相关分子Vimentin、β-catenin均表达显著增高;(5)人乳腺癌免疫组化双标实验结果:乳腺癌细胞TLR4与ALDH1A1的表达共定位。3.HMGB1激活TLR4增强了luminal型乳腺癌细胞对Tamoxifen的耐药性(1)Tamoxifen处理乳腺癌细胞MCF-7后,TLR4及干性转录因子OCT4、SOX2、Nanog表达增高,并呈剂量依赖;(2)CCK8检测细胞毒性实验显示:TLR4阳性MCF-7细胞的tamoxifen抗性强于TLR4阴性MCF-7细胞;(3)HMGB1处理后,TLR4阳性MCF-7细胞的tamoxifen抗性显著增强。4.HMGB1激活TLR4增强了三阴性乳腺癌细胞的侵袭转移能力(1)Transwell实验显示:加入TLR4外源性激活剂LPS后,穿出的MDA-MB-231乳腺癌细胞数量明显增多;(2)加入TLR4内源性激活剂HMGB1后,Transwell实验显示穿出的乳腺癌细胞数量也明显增多;(3)加入TLR4的拮抗剂TAK-242后,穿出的乳腺癌细胞数量明显减少;(4)当TLR4的配体HMGB1被拮抗后乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭能力显著减弱:GLY(HMGB1拮抗剂)处理后,Transwell实验显示穿出的乳腺癌细胞数量明显减少。5.人乳腺癌组织标本中TLR4及HMGB1的表达状况及联合检测意义(1)人乳腺癌标本中TLR4高表达患者的乳腺癌淋巴结转移率显著增高,但TLR4高表达组乳腺癌患者的总体生存期和无病生存期与低表达组无明显差异(p值分别为0.751和0.162);在luminal型乳腺癌和三阴性乳腺癌TLR4高表达患者也未检出有显著临床意义;(2)HMGB1蛋白(TLR4内源性配体)表达主要定位在细胞核和细胞浆,HMGB1在细胞核高表达比率75.4%(144/191),在细胞浆高表达比率为50.3%(96/191);(3)HMGB1细胞浆高表达组的肿瘤体积增大,KI-67表达增高(P<0.05),而HMGB1在细胞核高表达组无显著肿瘤恶性特征;(4)人乳腺癌标本中TLR4和HMGB1免疫组化双标实验结果显示,乳腺癌细胞TLR4高表达细胞的细胞核HMGB1往往低表达,而TLR4低表达细胞的细胞核HMGB1高表达;(5)人乳腺癌标本中TLR4和HMGB1联合检测结果显示:TLR4-HMGB1阳性组的乳腺癌淋巴结转移、肿瘤大小、临床分期均有显著意义(P<0.05),并且TLR4-HMGB1阳性组的总体生存率和无复发生存率均显著低于TLR4-HMGB1阴性组(P<0.05)。6.人乳腺癌组织标本中ASCL2的表达与TLR4表达显著正相关,ASCL2高表达患者预后不良(1)免疫组化检测人乳腺癌组织标本中ASCL2的表达,其免疫组化评分与TLR4的评分显著正相关。(2)乳腺癌患者中,79例(41.4%)样本检测出ASCL2高表达,112例(58.6%)样本ASCL2低表达。并且肿瘤组织中ALSCL2表达显著高于癌旁组织。在乳腺癌细胞系中,ASCL2表达定位于乳腺癌细胞的细胞核和细胞浆。(3)ASCL2在乳腺癌中的表达同肿瘤恶性程度呈正相关。ASCL2表达情况与肿瘤大小、淋巴结转移和Ki67的表达显著相关,有统计学意义(P<0.05),但与年龄、临床分期、分子分型无显著相关(P>0.05)。(4)ASCL2是乳腺癌患者独立的预后或复发指标。Kaplan-Meier分析表明ASCL2高表达是乳腺癌患者术总体生存率(Overallsurvival,OS)和无病生存率(Disease-free survival,DFS)的影响因素(P<0.05)。多因素Cox回归分析表明ASCL2表达水平是影响乳腺癌患者预后(HR=1.865,P=0.001)和复发(HR=1.278,P=0.055)的独立因素。7.乳腺癌患者外周血TLR4基因检测显示TLR4是潜在的乳腺癌易感性检测基因(1)在24例乳腺癌患者外周血TLR4基因检测中,1例患者在Chr9:120474941(H179N)位置上存在杂合碱基突变,由CAC(编码组氨酸)突变为AAC(编码天冬氨酸);(2)突变患者临床信息显示对Tamoxifen治疗反应不佳。