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Maedi-Visna病毒(Maedi-Visna virus,MVV)是反转录病毒科慢病毒属的成员之一,主要侵染宿主的单核/巨噬细胞系的细胞,以损害绵羊的多种器官为特征。临床上以绵羊严重消瘦、呼吸困难、麻痹、跛行、由淋巴组织增生而致乳腺硬化、间质性进行性肺炎等为特征。梅迪-维斯纳病最早于1915年在美国的蒙大拿被发现,目前呈世界性分布。该病潜伏期长,可通过母羊哺乳及呼吸道和消化道广泛传播,无有效的药物和疫苗对其进行防制。从60年代后期开始,我国有报道绵羊梅迪-维斯纳病的发生,并于1984年首次从血清学角度确定了该病在我国的存在,1985年从血清学阳性的绵羊体内分离到该病毒。该病的传播对绵羊养殖业造成了严重的危害。本实验鉴于此原因对我所保存的MVV毒株进行序列分析,并与该病毒其他毒株进行了序列比较,及对其核酸疫苗进行了免疫学研究,以确定该病毒的来源,对该病的防制奠定了基础。MVV基因的克隆目的:对保存的来源于美国的MVV毒株(暂时用MVV-am表示)的基因进行克隆、测序及序列分析,通过与原美国株MVV-85/34和亲本株MVV-1514相比,确定其变异率,同时为其核酸疫苗的研究搭建平台。方法:根据Genbank中发表的绵羊梅迪-维斯纳病毒美国株85/34的基因组序列(检索号:AY101611)设计合成了4对引物,用蛋白酶K法提取MVV前病毒DNA,对主要基因片段进行PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果:与原美国株MVV-85/34相比,MVV-am在传代过程中发生了变异,变异率约为3.1%。其中MVV-am的LTR和pol基因相对变异较大,gag基因核心部分变异相对最小。和亲本株MVV-1514相比变异较大,同源性约为90.1%,且发生了核苷酸的缺失。结论:我们保存的来源于美国的MVV毒株与原美国株MVV-85/34相比,核苷酸发生了变异,同源性大约为96.9%。而与亲本株MVV-1514相比,核苷酸变异相对较大。MVV主要保护性抗原基因的克隆和序列分析目的:针对MVV的主要保护性抗原gag基因(P51)进行克隆、序列分析及抗原性分析,以明确其抗原性,为MVV核酸疫苗的构建奠定分子基础。方法:根据国外发表的MVV美国株的gag基因及其核心片段的核苷酸序列设计引物,从MVV前病毒DNA中扩增gag基因片段,将其插入到pEGM-T easy克隆载体中,构建重组质粒pEGM-T-gag,转化大肠杆菌DH5α后,筛选阳性克隆进行序列测定和比较分析。利用ATHENPROT软件对其抗原性进行比较和分析。结果:本实验所克隆的gag基因与MVV美国株gag基因的核苷酸和氨基酸的同源性为别为98.2%和96.9%;gag基因核心片段编码蛋白的抗原性与MVV-85/34及MVV-1514株基本一致。结论:克隆得到gag基因片段,且该基因编码蛋白具有较高的抗原性。MVV核酸疫苗真核表达载体的构建及表达目的:构建MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag并转染COS-7细胞,检测核酸疫苗和重组质粒在真核细胞中瞬时表达的情况。方法:将克隆的gag基因片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/TO中,构建了MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag。将上述质粒以及空载体pcDNA5/TO用脂质体介导法转染COS-7细胞48小时后,经免疫组化、ELISA、western blot及RT-PCR等方法检测重组质粒在COS-7细胞中的表达。结果:免疫组化发现重组质粒pcDNA5/TO-gag转染的COS-7细胞在细胞核周围呈现棕色,说明重组真核表达质粒pcDNA5/TO-gag在COS-7细胞中有相应蛋白的表达,而