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木材来源于树木茎干的次生生长。形成层细胞经过增殖、向木质部分化、次生细胞壁沉积和程序性细胞死亡等一系列细胞学过程,最终形成木材。因此,阐明形成层的建立及活性维持的机制对木材形成至关重要。转录因子和植物激素信号已被发现对形成层的发育具有关键调控作用。赤霉素信号在其中扮演关键角色。外施赤霉素显著促进杨树形成层细胞的增殖活动,表明赤霉素对于形成层活性具有重要调控作用。然而,目前赤霉素调控形成层活性的分子机制尚不清晰,亟待进一步探究。杨树的用途广泛,具有巨大的经济效益和生态效益,也是研究木材发育的模式植物。本论文以毛白杨为研究材料,对赤霉素信号通路关键阻遏子DELLA与形成层调控因子ARK2和WOX4开展蛋白互作研究,并通过一系列生化、分子与遗传实验,解析了DELLA、ARK2和WOX4的蛋白互作介导赤霉素调控杨树形成层活性维持的分子机制。主要研究结果如下:(1)赤霉素促进杨树形成层细胞的分裂活性对一个月龄的野生型杨树组培苗进行多效唑(赤霉素合成抑制剂)外施处理。一个月后,切片观察茎维管形成层的表型。经多效唑处理后,维管形成层细胞层数显著减少,分裂活性明显降低。赤霉素合成受到抑制后,形成层发育也随之受到影响,表明赤霉素正向调控维管形成层的分裂活动。(2)DELLA蛋白与形成层关键因子ARK2和WOX4蛋白的组织表达定位和亚细胞定位重叠利用Asp Wood网站数据,分析DELLA、ARK2以及WOX4在木材发育相关组织中的表达模式,发现DELLA、ARK2与WOX4在形成层中的表达高度重叠。构建ARK2启动子驱动的GUS报告株系,发现ARK2在茎中表达量最高,在成熟茎中的形成层区域特异性表达。亚细胞定位结果显示DELLA、ARK2与WOX4均定位于细胞核中。(3)DELLA、ARK2与WOX4蛋白彼此之间均能发生直接互作酵母双杂交以及双分子荧光互补实验表明,DELLA、ARK2与WOX4在体内与体外均能发生蛋白直接互作。结构域截短实验解析了三者之间的互作结构域。因ARK2与WOX4都与DELLA的GRAS结构域发生互作,推测二者可能竞争性结合DELLA蛋白。(4)DELLA抑制ARK2与WOX4的蛋白互作及其对下游基因表达的调控由于WOX4会与ARK2的KNOX1结构域发生互作,而DELLA与ARK2的互作位点也依赖于KNOX1结构域。因此,DELLA与ARK2的结合可能会破坏ARK2与WOX4直接的蛋白互作。通过萤光素酶互补成像分析,发现DELLA蛋白能够显著干扰ARK2与WOX4之间的互作。Effector-Reporter实验证明,DELLA影响ARK2和WOX4对下游基因的调控。(5)ARK2基因调控杨树形成层活性为了确定ARK2在杨树次生发育中的功能,构建其超表达植株。超表达ARK2引起节间长度变短以及株高增加。切片观察显示,形成层区域变宽,层数增加,而木质部区域明显变窄,细胞层数减少。这些结果表明,ARK2促进形成层分裂而抑制向木质部一侧分化。相比之下,ARK2敲除株系则株高和节间长度增加,茎杆增粗。切片观察结果显示,ARK2敲除株系和其RNAi株系的形成层区域均变窄,细胞层数减少。因此,敲除ARK2或降低其表达导致形成层活性减弱。(6)超表达WOX4促进形成层活性为了研究WOX4对杨树形成层活性的影响,构建其超表达植株,筛选出表达量较高的株系用于开展进一步表型分析。切片结果表明,WOX4a超表达株系具有更多的形成层细胞层数和更宽的形成层区域,也产生了更多的次生木质部。因此,WOX4a正向调控杨树形成层细胞的增殖与分化活动。(7)ARK2与WOX4协同调控形成层活性为了探究杨树茎中ARK2与WOX4互作是否存对形成层调控具有叠加效应,我们将WOX4a和WOX4b双敲除载体转入ARK2敲除的遗传背景中,筛选出三者共敲的株系。切片结果显示,ARK2单敲株系形成层层数减少,而ARK2、WOX4a与WOX4b的共敲株系的形成层表型要比ARK2单敲株系更为显著,形成层表型受到明显破坏,发育极为异常,几乎很难形成正常的形成层细胞。这些结果表明,ARK2与WOX4对形成层活性具有协同调控作用,从而导致共敲株系的形成层表型比单敲株系更为明显。(8)DELLA抑制ARK2与WOX4对形成层活性的促进作用为了研究DELLA通过蛋白互作对ARK2以及WOX4的影响,我们对ARK2与WOX4a超表达株系进行了多效唑(赤霉素合成抑制剂)处理。赤霉素合成受阻,会导致植物体内DELLA蛋白的量发生累积。对多效唑处理一个月的幼苗进行切片观察,结果显示多效唑处理后的转基因株系形成层层数减少,证实了DELLA可能会抑制ARK2与WOX4a对形成层活性的促进作用。综上所述,赤霉素对形成层的调控由其信号通路中的阻遏因子DELLA蛋白介导。DELLA通过与形成层关键调控因子ARK2与WOX4发生蛋白互作,影响ARK2与WOX4对下游靶基因的调控,从而抑制杨树形成层分裂活性。ARK2与WOX4通过蛋白互作协同调控形成层的发育活动。DELLA蛋白则与ARK2、WOX4分别互作,并干扰两者的蛋白相互作用,从而影响形成层活性。