研究背景与目的MicroRNAs (miRNAs或miRs)在人类各种疾病的发展,细胞分化,增殖,周期调控,细胞死亡中发挥重要的作用,也包括肿瘤的发生与发展。MiR-3188作为近年来新发现的miRNA,在肿瘤中的功能和机制目前还未有任何报导。鼻咽癌是发生于鼻咽粘膜的一种上皮来源的恶性肿瘤,通常集中发生在东南亚地区,鼻咽癌的发生可能与EB病毒感染、特定饮食习惯、基因易感性等因素有关。尽管在美国非常少见,却占儿童鼻咽肿瘤的三分之一。在现在的研究中,miRNAs的异常表达广泛涉及到了鼻咽癌的病理进程。比如,EBV病毒编码的microRNA BART1通过调控PTEN介导的信号通路促进了鼻咽癌细胞的转移。此外,在前期的研究中,我们发现抑癌基因PDCD4通过调控miR-184进而抑制c-MYC和BCL2的表达来调节鼻咽癌细胞的增殖和凋亡。FOXO1转录因子属于翼状螺旋/叉头转录因子家族中的一员,AKT能够促进FOXO1磷酸化从而出核而失去活性。以前研究表明FOXO1主要通过调节细胞周期进展,分化,代谢以及凋亡而发挥肿瘤抑制因子的作用。进一步的,FOXO1的低表达已经在多种肿瘤里面展示,比如霍奇金淋巴瘤,乳腺癌,横纹肌肉瘤等等。虽然该基因在肿瘤研究已经有较多的报道,然而在鼻咽癌中,该基因功能和具体的分子机制几乎没有报道,目前仅有研究表明FOXO1参与了LMP1介导的鼻咽癌细胞周期进展以及化疗抵抗；高表达的磷酸化的AKT与磷酸化的FOXO1有相关性。在本次研究中,我们分析了miR-3188, mTOR和FOXO1在鼻咽癌中的关系并且发现miR-3188-mTOR-pPI3K/AKT-c-JUN变异环路,这个变异环路抑制了鼻咽癌细胞的增殖,为鼻咽癌发生发展的分子机制研究提供新思路。研究内容与方法1.miR-3188对鼻咽癌细胞生物学功能的影响及其分子机制(1)利用MTT实验、平板克隆形成实验、细胞周期、Edu与裸鼠皮下成瘤实验观察miR-3188对细胞生长、增殖能力的影响,确定miR-3188在鼻咽癌细胞中的功能；(2)为了明确miR-3188抑制鼻咽癌细胞增殖的机制,Western blot检测miR-3188对p-AKT, p-PI3K, c-JUN, CCND1, P21, P27蛋白表达的影响。2.miR-3188靶基因验证(1)利用生物信息学软件预测nTOR为miR-3188的一个直接靶标；(2)荧光定量PCR检测过表达或干扰miR-3188的细胞中mRNA水平mTOR表达的变化；(3) Western blot实验检测过表达或干扰miR-3188的细胞中蛋白水平mTOR和p-mTOR表达的变化；(4)免疫组化实验检测过表达miR-3188的裸鼠皮下成瘤组织中mTOR的表达；(5)利用双荧光素酶报告实验确定miR-3188直接靶向mTOR;(6)MTT实验,Edu实验和细胞周期实验检测mTOR对过表达miR-3188的鼻咽癌细胞增殖功能的影响；(7) Western blot检测干扰mTOR后下游基因nTOR, p-mTOR, PI3K, P-PI3K, AKT, P-AKT, CCND1和c-JUN的变化。3. C-JUN通过结合在miR-3188的启动子区抑制其表达(1)为了预测miR-3188的转录调节作用,利用生物信息学软件分析了miR-3188转录起始位点上游3000kb的长度,发现有3个c-JUN的结合位点；(2)荧光定量PCR检测干扰c-JUN的鼻咽癌中,miR-3188表达的改变；(3) EMSA实验证明miR-3188启动子上c-JUN的三个结合位点是否有效；(4)CHIP实验进一步证明c-JUN与miR-3188的启动子结合；(5)双荧光素酶报告实验验证c-JUN能够调节miR-3188启动子区的活性进而抑制其转录。4. FOXO1在鼻咽癌中的功能和机制研究(1)利用MTT实验、平板克隆形成实验、细胞周期、Edu与裸鼠皮下成瘤实验观察FOXO1对细胞生长、增殖能力的影响,确定miR-3188在鼻咽癌细胞中的功能；(2)为了明确miR-3188抑制鼻咽癌细胞增殖的机制,Western blot检测FOXO1对p-AKT, p-PI3K, c-JUN, CCND1, P21, P27蛋白表达的影响；(3)用免疫荧光和免疫组化实验证明FOXO1能够调控c-JUN的表达水平；(4)CHIP实验验证过表达FOXO1使c-JUN与miR-3188的启动子区结合量减少。5. FOXO1调节miR-3188的表达(1)应用miRNAs表达谱芯片筛选过表达FOXO1后差异表达miRNAs,选取表达差异显著的miR-3188用荧光定量PCR进一步验证；(2)MTT实验,Edu实验检测在过表达FOXO1的鼻咽癌细胞中加入miR-3188inhibitor能否逆转过表达FOXO1的功能；(3) Western blot实验检测在过表达FOXO1的鼻咽癌细胞中加入miR-3188inhibitor能否逆转相关蛋白的表达水平；(4)加入PI3K抑制剂Ly294002验证FOXO1是否通过PI3K/AKT信号通路调节miR-3188的表达。6.miR-3188在鼻咽癌组织中的表达特性及相关性分析(1)荧光定量PCR检测miR-3188在鼻咽癌组织,鼻咽癌细胞和鼻咽黏膜组织中的表达情况；(2)利用原位杂交的方法检测miR-3188在鼻咽癌组织和鼻咽黏膜组织中的表达情况；(3)荧光定量PCR检测mTOR, C-JUN, FOXO1在鼻咽癌组织和鼻咽黏膜组织中的表达情况；(4)MiR-3188与mTOR, C-JUN, FOXO1的相关性分析。结果1.miR-3188抑制鼻咽癌细胞的增殖(1)荧光定量RCR结果显示miR-3188在永生化鼻咽上皮细胞NP69和SXSW-1489中表达高于鼻咽癌细胞；(2)体外功能试验MTT,平板克隆,细胞周期,Edu实验结果显示,在HONE1-EBV和SUNE1细胞株中过表达miR-3188显著抑制了细胞周期G1向S期转化；在5-8F和NP69细胞中抑制miR-3188显著促进了细胞周期G1向S期转化；(3)裸鼠皮下成瘤实验证明了过表达miR-3188的鼻咽癌细胞体内成瘤能力明显降低,ki-67和PCNA的表达量与对照组相比也明显降低,这表明了miR-3188在体内抑制肿瘤形成；(4)机制研究表明了在鼻咽癌细胞HONE1-EBV和SUNE1中miR-3188过表达降低了c-JUN和CCND1的表达但是增强了p27和p21的变达,miR-3188inhibitors能够恢复降低的水平。有趣的是,干扰5-8F细胞中的miR-3188表现出了相反的作用,miR-3188 inhibitor也能够逆转这个相反的作用。进一步我们发现p-PI3K,p-AKT在过表达miR-3188的HONE1-EBV和SUNE1细胞中低表达而在miR-3188表达抑制的的5-8F中高表达。综合以上结果表明了miR-3188可能通过失活PI3K/AKT信号通路以及下游的c-JUN来抑制鼻咽癌细胞生长和细胞周期G1向S期转换。2.miR-3188直接靶向mTOR并抑制其表达(1)利用生物信息学软件TargetScan和RNAhybrid algorithms预测到mTOR是miR-3188的一个靶基因：(2)PCR结果显示在过表达miR-3188的HONE1-EBV和SUNE1细胞中mTOR表达水平降低,而在干扰miR-3188的5-8F和NP69细胞中mTOR表达水平升高；(3)与体外结果相似,免疫组化在移植瘤中检测mTOR的表达水平,结果表明过表达达miR-3188的移植瘤中mTOR表达水平降低；成功构建了psiCHECK-2/mTOR wt 3’UTR质粒和psiCHECK-2/mTORmt3’UTR质粒,分别与miR-3188 mimics、miR-3188 inhibitor共转染293FT细胞,以psiCHECK-2空载质粒作为对照组,转染48h后检测荧光素酶活性。结果表明,psiCHECK-2/mTOR wt 3’UTR和miR-3188 mimics共转染可明显降低荧光素酶的活性,差异具有统计学意义(t--7.07,P=0.002),而与miR-3188 inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性,差异具有统计学意义(t=-4.90,P=0.008)。突变质粒psiCHECK-2/mTOR mt 3’UTR分别与miR-3188 mimics和inhibitor共转染后,荧光素酶活性没有明显变化(t=-2.41, P=0.074; t=-2.46,P=0.070)。以上结果表明,miR-374a能够特异性结合mTOR3’UTR。3. mTOR过表达能够逆转miR-3188的功能和机制(1)MTT和Edu实验证明了在过表达miR-3188的鼻咽癌细胞中瞬转mTOR质粒增强了细胞的增殖能力及促进了细胞周期G1向S期转化；(2)进一步的我们发现miR-3188过表达增强了c-JUN和CCND1的表达但是降低了p27和p21,这些结果表明了mTOR过表达能够逆转miR-3188的抑制功能；(3)接下来,我们发现,干扰mTOR表达后,mTOR, p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, CCND1和c-JUN的表达水平明显降低,而p27和p21的表达水平显著升高,这些结果一致于miR-3188过表达的结果,说明miR-3188直接靶向mTOR进而抑制细胞增殖。4. C-JUN直接结合到miR-3188的启动子区抑制其转录(1)生物信息学软件预测了miR-3188启动子区C-JUN的3个结合位点分别在miR-3188启动子上游-492～-498,-1628～-1634,-2356～-2362。分别命名为结合位点A、B、C；(2)荧光定量PCR结果表明了干扰C-JUN后,miR-3188的表达水平显著增高,说明了C-JUN位于miR-3188的上游调节其表达；(3) EMSA结果显示DIG-ddUTP标记的C-JUN探针与SUNE1和HONE1-EBV的核蛋白共同孵育形成了一条迁移条带(泳道2和8),而加入未标记的寡核酸c-JUN与之探针竞争性结合则不显示条带(泳道6和12)。当突变型的A、B、C竞争性结合SUNE1和HONE1-EBV细胞中DIG-ddUTP-标记的A、B、C时条带不受影响(泳道3-5,泳道9-11)。EMSA实验结果表明了miR-3188启动子区的c-JUN的3个结合位点都是有作用的。(4)CHIP实验进一步证明了c-JUN能与miR-3188启动子区的三个位点结合；(5)进一步的我们发现在HEK293T, SUNE1和HONE1-EBV细胞中过表达C-JUN能够降低miR-3188启动子的活性,在HEK293T, SUNE1和HONE1-EBV细胞中同时突变结合位点A和B,结合位点B和C,结合位点B和C之后,荧光素酶活性也明显降低；同时突变A,B,C三个结合位点后不影响荧光素酶活性。这些结果表明了C-JUN能够结合miR-3188的启动子区抑制其表达。5. FOXO1抑制PI3K/AKT信号通路(1)为了验证FOXO1在鼻咽癌细胞中的功能,我们用慢病毒在鼻咽癌细胞中过表达了FOXOl。MTT,平板克隆,细胞周期,Edu实验结果显示,在HONE1-EBV和SUNE1细胞株中过表达FOXO1显著抑制了细胞周期G1向S期转化；而在过表达FOXO1的细胞中加入促进了细胞周期G1向S期转化；(2)裸鼠皮下成瘤实验证明了过表达FOXO1的鼻咽癌细胞体内成瘤能力明显降低,ki-67和PCNA的表达量与对照组相比也明显降低,这表明了FOXO1在体内抑制肿瘤形成；(3)机制研究结果显示,过表达FOXO1显著抑制了p-PDK, p-AKT, mTOR和p-mTOR的表达。进一步的,外源性的FOXO1下调了c-JUN和CCND1的表达但是上调了p21和p27的表达。有趣的是,相反的结果出现在siRNA介导的抑制过表达FOXO1的细胞中。更进一步的,P13K抑制剂Ly294002显著的逆转了p-PDK, p-AKT, mTOR, p-mTOR, c-JUN, CCND1, p21和p27的表达水平；(4)免疫荧光实验证明了在过表达FOXO1的鼻咽癌细胞中C-JUN的表达水平下调,而免疫组化实验也证明了过表达FOXO1的移植瘤中C-JUN的表达水平降低。进一步的,CHIP实验证明了与对照细胞相比,在过表达FOXO1的鼻咽癌细胞中C-JUN与miR-3188启动子区的结合能力明显降低。这些结果都表明了FOXO1通过调节PI3K/AKT/c-JUN信号通路调节鼻咽癌细胞的增殖以及细胞周期的进展。6. FOXO1抑制PI3K/AKT/c-JUN信号通路诱导miR-3188的表达(1)荧光定量RCR证明了FOXO1正向调节miR-3188；(2)MTT和Edu实验表明了用miR-3188特异抑制剂抑制miR-3188的表达后能够逆转过表达FOXO1抑制细胞增殖的功能；(3) Western blot结果显示miR-3188抑制剂增加了p-PI3K, p-AKT, c-JUN和CCND1的表达但是减少p27和p21的表达在FOXO1过表达的鼻咽癌细胞中；(4)PI3K特异性抑制剂能够逆转同时加入siFOXO1和FOXO1细胞中miR-3188的水平；这表明了FOXO1能够通过PI3K/AKT正向调控miR-3188的表达以上这些结果证明了FOXO1抑制PI3K/AKT/c-JUN信号通路诱导miR-3188的表达。7.miR-3188与临床病理参数的关系(1)与正常鼻咽咽黏膜组织相比,miR-3188在鼻咽癌细胞和鼻咽癌组织中低表达(分别为P=0.00037,P=0.00033)；(2)进一步的,原位杂交结果证实了miR-3188在鼻咽癌组织中低表达；(3) 临床病理资料显示,在142例鼻咽癌组织中,miR-3188与病人的年龄,性别,临床分期,淋巴结转移(N分期)和远处转移(M分期)没有相关性,但与肿瘤的大小(T分期)呈负相关(P=0.011)；(4)生存分析结果显示,高表达miR-3188更有利于患者的预后。8.miR-3188与mTOR, FOXO1和c-JUN的相互关系(1)荧光定量PCR结果表明与正常鼻咽黏膜组织相比,mTOR和c-JUN在鼻咽癌中表达上调(分别是P=0.0282,P<0.0001),FOXO1在鼻咽癌组织中表达下调(P<0.0001)；(2)在鼻咽癌组织中,miR-3188与mTOR表达呈负相关(P=0.0288),与C-JUN表达呈负相关(P=0.0006),而与FOXO1表达呈正相关(P=0.0326)。结论1.miR-3188通过PI3K/AKT信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖；2.miR-3188直接靶向mTOR;3. mTOR过表达逆转了miR-3188介导的细胞生长抑制；4. C-JUN直接结合到miR-3188的启动子区；5. FOXO1通过PI3K/AKT/C-JUN信号通路诱导miR-3188的表达并抑制鼻咽癌细胞的增殖；6.miR-3188表达下调在鼻咽癌中是一个不利的预后因素,miR-3188的表达与FOXO1正相关,与mTOR和c-JUN的表达呈负相关。