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前言:
疟疾是由疟原虫感染引起的严重威胁人类生命的感染性疾病之一，但目前尚未有应用于临床的有效疟疾疫苗。动物模型和人体研究的结果均已表明:CD4+T细胞在抵抗红内期疟原虫感染过程中发挥着至关重要的作用。感染急性期以IFN-γ为主导的Th1型细胞免疫应答及巨噬细胞等免疫细胞的活化可有效地遏制疟原虫的爆发性增殖。对于疟原虫的肝内期感染阶段，动物实验结果表明保护性作用有赖于CD8+T细胞活化所介导的特异性细胞免疫应答，CD4+T、IFN-γ及中和性抗体也发挥重要作用。因此有效提高细胞免疫应答成为抗疟疫苗研究的重要策略。
单核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种革兰阳性胞内寄生菌，它可引起人类食物源性感染。该菌的生物学特性及其诱导免疫应答的特点使其成为极好的疫苗载体。在抗肿瘤、抗感染以及免疫调节等方面的作用越来越受到关注。同时Lm的自然感染途径是经口感染，因而可诱导粘膜免疫应答。它相对安全，对健康人的致病力较弱，近年来制备了多种减毒株，部分已通过Ⅰ期临床实验，安全性获得认证。
本研究中，我们建立了Lm与鼠疟共同感染模型，观察到Lm处理对P.y17XL感染小鼠具有保护作用。我们进一步研究了Lm在疟原虫感染进程中的免疫修饰作用及其产生免疫调节作用的机制，为疟疾的疫苗研制提供新的思路。
实验方法:
1、实验动物、疟原虫及菌株
6～8周雌性C57BL/6、BALB/c小鼠，SPF级，由中国医学科学院实验动物研究所提供（许可证编号:SCXK京200420001）。致死型约氏疟原虫P.y17XL(Plasmodiumyoelii17XL)液氮冻存，由BALB/c小鼠周期性复苏传代。野生型李斯特菌Lm10403s由BALB/c小鼠传代后于TSB培养液中-80℃保存。热灭活李斯特菌(Heat-killed Lm，HKLm)由对数生长期Lm10403s PBS重悬后80℃热灭活1h，-80℃冻存备用。
2、实验动物感染
疟疾感染:C57BL/6、BALB/c每只小鼠经腹腔感染5×105P.y17XL寄生红细胞。P.y17XL感染后第3天开始，尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，动态监测原虫血症水平、生存率。
Lm感染:于P.y17XL感染两天后（除在文中特殊注明外）经尾静脉感染李斯特菌，Lm10403s感染剂量400ul，BALB/c1×103 CFU，C57BL/61×104 CFU，HKLm感染剂量400ul，1×109 CFU。对照组注射同等剂量PBS。
3、脾细胞培养
无菌摘取小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用含10％FCS的RPMI1640调整脾细胞终浓度至1×107个/ml，于24孔培养板(Costar)中，每孔加入500ul细胞悬液，一式3孔，培养48h。收集培养上清，于-80℃保存，待NO测定。
4、流式细胞术
FACS检测小鼠脾细胞CD4+T、CD8+T、CD11b+各细胞群百分比及细胞内细胞因子IFN-γ分泌情况，使用WINMDI2.9进行分析。
5、NO水平检测
Griess试剂检测脾细胞培养上清中NO含量，100ul细胞培养上清液和100ulGriess反应液室温反应10min，酶标仪检测550nm处OD值。以NaNO2作为标准品进行浓度换算。
6、Realtime PCR检测细胞因子
TRIzol匀浆提取脾脏组织mRNA，反转录为cDNA后，保存于-20℃作为RealtimePCR的模版，将RPS17作为内参基因，检测IFN-γ、 IL-4、IL-12P40及IL-10基因表达水平。
7、统计学处理
使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验对数据做统计分析。P＜0.05代表差异具有统计学意义。
实验结果:
1、接种Lm对P.y17XL感染小鼠原虫血症水平及生存率的影响Lm抵抗品系C57BL/6小鼠在不同时间接种Lm的三组小鼠原虫血症水平均低于单独感染P.y17XL对照组，并未观察到生存率的差异;对Lm及P.y17XL更加易感的BALB/c小鼠Lm组在P.y17XL感染4天后相对于对照组原虫血症水平明显下降，生存时间延长。
2、接种Lm对P.y17XL感染C57BL/6小鼠Th1型应答的影响
P.y17XL感染后第5天，接种Lm的C57BL/6小鼠脾细胞Th1型细胞因子IFN-γ分泌水平与对照组相比明显升高，Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平无明显差异;Lm组CD11b+细胞百分比出现明显升高，脾细胞培养上清NO水平也显著高于对照组;Lm组CD4+、CD8+T细胞数量与对照组基本相同，但Lm组CD4+、CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平与对照组相比，明显升高。
3、IFN-γ与Lm对P.y17XL感染保护作用的关系
P.y17XL感染后第3天（Lm感染后一天），Lm组IFN-γ分泌水平与对照组相比明显升高约5倍，HKLm组IFN-γ分泌水平与对照组相似，Lm组IL-12水平较低，与另两组无差异。对照组IL-4水平相比另两组出现有意义升高。C57BL/6小鼠HKLm组、Lm组虫血症在P.y17XL感染后的前5天相比于对照组一直保持在较低水平，Lm组5天后逐渐下降，并始终在保持10％以下，但HKLm组5天后开始逐渐上升至第8天与对照组基本一致。
结论:
1、Lm对P.y17XL感染的小鼠具有免疫保护作用;
2、Lm增强P.y17XL感染小鼠的Th1应答;
3、Lm对P.y17XL感染小鼠的免疫保护作用与感染早期诱导IFN-γ分泌有关。