从小麦胚中分离出高纯度的麦胚凝集素(WGA),并且对其抑肿瘤活性、结构及配体结合特性进行了研究,主要研究内容如下:建立了方便、灵敏、可靠的红细胞凝集活性检测方法,对于红细胞进行蛋白酶处理、戊二醛固定,采用pH7.2等渗磷酸盐缓冲液作为工作液,改用光径0.5cm比色池代替Liener法采用的试管,确定读取测定终点的时间为2小时处,扣除红细胞自身的沉降,引入外标对测定结果进行校正,采用5次测定结果平均值计算活力。建立的测定方法灵敏度满足需要,相对偏差只有Liener法的25%。避免了使用天然红细胞测定时频繁需要重新配制的问题。对于WGA的制备工艺进行了改进和优化。确定从小麦胚芽中提取WGA的最佳条件为:提取时间3.4h,甲酸浓度0.5mol/L,液料比10.15。综合应用盐析分级、选择性热处理、部分水解NAcGlc亲合层析、凝胶过滤层析等方法对WGA进行纯化,成品在SDS-PAGE上显示单带并且与Sigma标准品迁移率相同,相对分子质量计算结果与PDB记录基本一致。利用SP-Sephadex离子交换层析纯化得到WGAII,氨基酸组成与PDB蛋白质数据库记录相符。WGAII对于MCF-7和SHZ两种乳腺癌细胞增殖的最大抑制率均出现于加药后72h,其中SHZ尤为敏感。WGAII对SHZ细胞的LD50约为10 μg/ml。WGAII作用使细胞皱缩或拉长,部分细胞簇集成团,有些细胞脱壁,细胞表面反光性变差。细胞膜皱缩、外突或粘连,有的小泡破裂,或脱落形成凋亡小体。WGAII将SHZ细胞阻断在G1/S期,干扰了肿瘤细胞的正常增殖活动。FT-IR谱及Raman光谱分析表明,WGAII与WGAI、WGAIII固体的α螺旋含量都比较低;WGAII的β折叠、β转角和无规线圈含量介于WGAI、WGAIII之间。Raman光谱分析表明,在高浓度酸性溶液中,WGAII分子中含有大量无规线圈和一定数量α螺旋;而WGAI分子中含有大量无规线圈、较多β螺旋和一定数量α螺旋;WGAIII分子中含有较多α螺旋<WP=11>和无规线圈,以及一定数量β折叠。在高浓度中性溶液中,WGAII分子中含有大量无规线圈和相当数量α螺旋;而WGAI和WGAIII分子中含有一定数量无规线圈及α螺旋。Raman光谱分析表明,WGAII固体的Phe信号介于WGAI、WGAIII之间;WGAII与WGAI、WGAIII的Tyr残基暴露程度相近,暴露的-OH可以同时充当氢键的供体和受体;WGAII和WGAIII的Trp处于具有一定疏水性的环境中,WGAI的部分Trp吲哚环位于非疏水环境,甚至可能与水分子接触。在高浓度酸性溶液中,WGAII和WGAIII的不出现Phe信号,WGAI给出一定强度的信号;而WGAII的 Tyr -OH完全暴露,WGAI的 Tyr埋藏于分子内部,为Asp和Glu残基充当氢键供体,WGAIII的Tyr则与带负电的受体形成极强的氢键;WGAII和WGAI的Trp处于具有一定疏水性的环境中,WGAIII的部分Trp吲哚环位于非疏水环境,甚至可能与水分子接触。在高浓度中性溶液中,WGAII和WGAI不出现Phe信号,WGAIII给出一定强度的Phe信号;WGAII的 Tyr -OH完全暴露,WGAI的Tyr与带负电的受体形成极强的氢键,WGAIII的Tyr暴露的-OH可以与溶剂相互作用,同时充当氢键的供体和受体;WGAII和III的Trp处于具有一定疏水性的环境中;WGAI的部分Trp吲哚环位于非疏水环境,甚至可能与水分子接触。CD谱表明,在低浓度溶液中,WGAII的二级结构组成基本不受亚基解离和酚羧酸基(pKa>3.2)质子化状态的影响。WGAII与糖配体在中性环境中低浓度下的亲合作用高于酸性环境;在相同条件下这种亲合作用随着糖配体聚合度的增加而增强。不同激发波长和不同作图计算法得到的Ka数值有一定差别,可以认定在误差范围内。WGAII与糖配体在酸性环境中高浓度下的亲合作用比在低浓度下更弱,但是差别在一个数量级之内。WGAII分子中Trp残基存在于极性较强的环境中。WGAII与(NAcGlc)3、(NAcGlc)2发生亲合作用后,荧光谱峰的蓝移和量子产率的小幅度增加,表明Trp残基微环境的疏水性略有增加;而WGAII与NAcGlc发生亲合作用后,峰位基本保持不变,表明Trp残基微环境的疏水性基本不变。Hill和Scatchard作图具有良好的线性,指示分子内的Trp残基直接参与亲合作用。在中性环境中,NBS可以修饰WGAII的一个Trp残基。NBS修饰 WGAII在中性环境中与配体亲合作用的Ka随着配体聚合度的增加而增强,但是Ka数值比天然WGAII大幅度降低;而在酸性环境中则不发生上述亲合作用。在pH6.8环境中,WGAII分子中有一个可被NBS修饰的Trp残基,该残基对于pH3.2条件下的亲合作用至关重要,对pH6.8条件下的配体亲合作用也起到重要作用。Hill和Scatchard作图具有良好的线性,指示分子内未被修饰的Trp残基直接参与亲合作用。WGAII的一个Trp残基被NBS修饰后,β折叠减少8.6%,无规线圈增加8.6%,使得分子内其余Trp残基所处微区成为疏水性微区。无论亚基解离与否,无论是否与配体形成复合物,WGAII的荧光均可被丙烯酰胺(Acr)和KI完全淬灭(fa≈1);不过与配体亲合形成复合物后,随着配体链长的增加,Acr对于WGAII荧光的淬灭常数(Ksv)逐渐降低,而KI淬灭的Ksv则逐渐增加。WGAII分子中参与糖配体亲合作用的某些Trp残基可能位于阳离子包围的疏水微区。Acr可以有效地淬灭WGAII荧光,其Ksv随Acr浓度增大而呈非线性增大,表明WGAII三个Trp残基的Acr可及性相近,或者以一个为主。在没有配体保护的情况下,Acr和KI淬灭WGAII荧光的过程中,发射峰中心波长基本不变;但是在有