柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,在亚洲、非洲、大洋洲和南北美洲的近50个国家和地区造成为害,在中国20个柑橘产区(包括台湾)已有12个遭受HLB为害,且最近又有不断扩散蔓延的趋势；HLB病原菌能侵染几乎所有柑橘类植物,病树症状表现复杂,主要表现为叶片斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“红鼻子”果等症状,造成植株经济寿命减短,产量降低,果品质劣经济价值降低,从而引起巨大的经济损失。由于HLB的病原物尚不能人工培养,因此科赫氏证病亦未完成。目前,国际上普遍认为该病的病原为韧皮部杆菌属的3个暂定种：亚洲种(’Candidatus Liberibacter asiaticus’, CLas)、非洲种(’Ca. L. africanus’, CLaf)和美洲种(’Ca. L. americanus’, CLam)。目前该病尚无特效药剂可供治疗,也无抗(耐)病品种可供应用,只能采取以防为主的防治措施。因此对该病的研究迫在眉睫且具有一定的难度。本研究从病害取样检测到田间症状识别,再到我国CLas种群分化和流行推测,以及探索防治该病害的新思路进行了较系统的基础性研究。其中田间诊断标准的确立在实际生产中对病害的准确识别具有重要的意义,由于HLB田间症状的复杂性,常会造成误判,如何进行准确诊断将是面对实际生产中亟待解决的最现实问题。而对病原菌的种群分化研究有助于了解病菌分类、种群结构和病菌流行动态,同时也为病原类型检测、病害诊断及风险评估提供了一种敏感特异的手段,因此区分CLas的不同株系对HLB的生态和流行学研究十分重要。鉴于国内外对CLas遗传多样性及种群分化领域研究的不足,尤其是对中国CLas种群内部多位点同时分析的缺乏,本学位论文利用比较基因组分析方法得到大量差异位点,通过筛选获得用于评价我国CLas的种群多样性的位点,并对306个样品进行多位点遗传多样性分析。旨在揭示中国CLas种群分化,并进一步探索黄龙病在中国的起源及其流行。HLB病原菌CLas寄生于柑橘体内,简单的化学防治难度很大,且可操作性不强。CLas基因组中存在编码CLas原噬菌体的溶菌酶基因,这是CLas噬菌体杀死CLas细胞的有力武器,本论文通过原核表达该溶菌酶,并进一步验证该基因的溶菌活性,希望借助CLas噬菌体源溶菌酶与韧皮部无毒载体结合,运用这个工具进行HLB的有效防控,从而为HLB防控提供新思路。目前取得了如下研究成果：1、首次通过在常规CTAB法DNA提取液中添加增效剂和抗低温析出剂,获得了一种增强型新配方CTAB-Triton DNA提取液,并优化操作时间,该法无论从质量上还是从操作时间上均优于常规CTAB抽提法,而质量和产量均高于微量抽提法,产量优于DNA提取试剂盒。运用实时荧光定量PCR对感病柚子叶片各部分病原含量进行检测,明确了柑橘黄龙病的取样部位应为叶柄或主侧脉。这为柑橘产业各种DNA病害模板样品的制备提供了一个新参考,同时对HLB病害检测取样部位的选择具有一定的实际指导意义。2、经2009-2013年田间柑橘黄化症状调查,我国柑橘系统性黄化症状主要由韧皮部杆菌属的亚洲种韧皮部杆菌引起,从所采集的629份样品中未发现美洲种、非洲种韧皮部杆菌和植原体。黄化症状样品分子检测和室内传毒症状观察表明叶片斑驳型黄化症状与CLas最相关,可作为田间诊断的主要依据,果实成熟期还可结合“红鼻子”果同时进行诊断,以提高田间诊断的高效性和可靠性。本研究明确了我国柑橘主产区近几年引起柑橘系统性黄化症状的主要病原,确立了HLB田间诊断标准,对HLB田间识别与诊断具有一定的指导意义。3、通过CLas与根瘤菌科成员进行比较基因组分析,筛选并设计79对引物,获得14个变异位点,其中12个变异较为丰富。对这12对引物进行退火温度优化,得到11个特异性较好的引物对来自中国9省306份CLas样品和1个巴西CLas样品进行PCR扩增,其中,6个位点能较好评估中国CLas种群类型,聚类结果显示中国CLas共分两大组,云贵川一组、两广闽赣浙为另一组。通过多个变异位点同时对CLas样品进行分析,从而推测中国CLas可能存在云南和广东两个起源中心。这为HLB在中国的起源和流行推测提供了一定的分子依据。4、首次提出使用(原)噬菌体源溶菌酶进行HLB防控的思路,通过CLas基因组查找,在CLas原噬菌体区域找到了编码溶菌酶蛋白的基因,并将其克隆测序验证序列后,通过构建pTXB1-Lysozyme原核表达载体,诱导获得41kDa大小的融合蛋白,且融合蛋白均为可溶表达,经几丁质柱纯化并去除标签,得到大小为19kDa的溶菌酶蛋白,和预期预测完全一致。该研究为后续CLas原噬菌体溶菌酶功能验证提供了一定的基础,并有望将该溶菌酶通过无毒载体引入柑橘韧皮部,发挥杀菌活性,从而抑制或防治柑橘黄龙病。综上所述,本研究面对实际生产和应用检测,对HLB的症状和CLas的相关性进行了系统研究,总结出较为可靠的HLB田间诊断标准；通过实验明确了HLB取样部位应选叶柄或叶脉,而不应选取叶肉；应用比较基因组筛选多态性位点的方法对中国CLas进行多位点种群分析,为中国CLas的种群分化和病害流行起源提供了一定的分子依据。对CLas原噬菌体源溶菌酶基因原核表达为确定该溶菌酶的功能和活性提供了基础,并有望后续利用溶菌酶防治CLas。