论文部分内容阅读
党参,我国传统中药,药食同源,中西部为其主要产区。具有养血生津、补中益气等功效,属传统补益类中药。党参的有效成分包括多糖及甾醇类等,其中党参多糖药理作用广泛,具有抗肿瘤、抗氧化、调节机体免疫、抗衰老等功效。山西省道地药材潞党参中多糖含量相比于其他产区显著高出2-4倍,具有断面油润等道地特征,表明党参多糖是党参质量评价的重要指标。但是近年来由于党参种质单一,引种混乱导致栽培党参质量严重下降,因而基于党参多糖的党参优良种质资源的选育迫在眉睫。从分子水平解析潞党参多糖代谢途径,挖掘党参多糖合成的关键基因,通过调节基因的表达实现对党参多糖含量的精准调控,进行潞党参种质资源的遗传改良,对提高潞党参药材质量促进药材的优质生产具有重要意义。本研究基于前期所构建的党参转录组数据库,结合qRT-PCR技术筛选出与党参多糖积累密切相关的候选基因CpnsLTP与CpCA并对二者进行了生物信息学分析;建立了党参VIGS沉默体系并对其进行了初步优化,成功构建了候选基因CpCA VIGS沉默表达载体;同时对课题组前期所克隆得到的党参Cp1-SST基因进行了真核表达载体的构建,为进一步解析潞党参多糖代谢途径奠定基础。主要研究结果如下:1.本研究基于前期所构建的党参转录组数据库,利用Unigene在不同组织中的FPKM值,筛选出与潞党参多糖含量变化密切相关的基因,进而利用qRT-PCR技术进一步验证候选Unigene在不同组织不同发育时期的表达量差异,结合课题组前期党参多糖含量变化趋势,筛选得到与党参多糖积累呈正相关的候选基因CpnsLTP和负相关的候选基因CpCA。2.利用TA克隆与生物信息学分析软件,对候选基因进行生物信息学分析,结果显示,CpnsLTP基因全长707 bp,含有一个348 bp的ORF,具有nsLTP特异性位点,属于AAI-LTSS超家族;CpCA基因全长1186 bp,包含一个789 bp的ORF,编码262个氨基酸,编码蛋白具有保守的CA催化位点,属于CA超家族,氨基酸序列比对结果显示与其他物种的CA氨基酸序列具有较高的相似度,通过构建系统进化树,结果显示CpCA同黄顶菊CA的亲缘关系相对密切,可聚为一支。3.利用党参CpPDS基因为报告基因,建立并优化党参VIGS侵染体系,结果显示当党参幼苗苗龄期为4周,侵染体积为4 mL,侵染浓度OD600为1.4时,可在侵染20天时出现党参叶片光漂白现象,相对于课题组前期需要42天才出现漂白现象,试验周期大大缩短至22天。根据CpCA序列,克隆得到其非保守区序列,构建了pTRV2-CpCA沉默表达载体,为下一步进行基因功能分析奠定基础。4.通过高保真DNA聚合酶扩增得到Cp1-SST基因的ORF全长,去除其终止密码子后,与真核表达载体pPICZαC进行连接,测序结果分析显示Cp1-SST真核表达载体pPICZαC-Cp1-SST构建成功,对重组质粒进行线性化后通过电转法将其转化至毕赤酵母X-33中,通过验证,目的基因成功与酵母基因组整合,为后续的Cp1-SST基因的酶学功能分析奠定基础。