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本文对atRA是否通过Smad2/3影响胚胎腭间充质细胞周期分布进行了深入研究。
方法和结果:
第一部分atRA诱导C57BL/6N小鼠腭裂模型的建立与形态学观察
方法:
1.建立atRA诱导C57BL/6N小鼠腭裂模型采用C57BL/6N小鼠合笼,查见阴栓日定为妊娠第0天。将atRA溶解于玉米油中配制成10mg/ml溶液。对照组为纯玉米油。在GD10随机取出一半妊娠母鼠分为两组,一组按照100mg/kg剂量给予atRA灌胃一次,另外一组给予相同剂量的玉米油灌胃。在GD12将剩余妊娠母鼠随机分为两组,一组同样按照100mg/kg剂量给予atRA灌胃一次,对照组给予相同剂量的玉米油灌胃。
2.扫描电镜观察胚胎腭。
3.HE染色观察胚胎腭。
结果:
1.GD10给予atRA组胎鼠的侧腭突在GD12.5和GD13.5时发育均较对照组短小在GD14.5时,对照组胎鼠腭突向上抬起至水平位置,并在GD15.5时开始接触融合,GD16.5时完全融合,形成完整的腭。而实验组侧腭突始终处于垂直位置,未能形成接触融合,最终形成小腭突腭裂。本组胎鼠腭裂的发生率为97.7%,而对照组未出现腭裂。
2.GD12给予atRA组胎鼠的双侧腭突在GD14.5前与对照组相比无明显差异,腭突在垂直生长期逐渐增大,并于GD14.5顺利抬起至水平生长位置。对照组腭突在GD15.5时逐渐接触融合,至GD16.5融合完毕。但是部分实验组胚胎在GD15.5时腭突接触后未能发生融合,并形成腭裂。
3.扫描电镜观察对照组腭突表面的被覆上皮在GD12.5和GD13.5呈铺路石样的外观。在腭突即将开始接触时,对照组腭突中嵴上皮表面伸出指状或球状突起,在双侧腭突靠拢过程中首先接触。这一现象在双侧腭突融合的过程中始终存在,直至融合过程结束。而GD10给予atRA组胎鼠的腭突表面上皮始终保持铺路石样外观,光滑完整,未见到任何突起。
4.HE染色观察GD10给予atRA组胎鼠的腭突在GD13.5时体积较小,GD14.5和GD15.5时腭突仍然处于垂直位置,最终形成较小的腭突和较宽的腭裂。GD12给予atRA组胎鼠的腭突在GD12.5和GD13.5的发育与对照组无明显差异。在GD14.5时对照组的胚胎腭中嵴上皮成为单层;而实验组仍为双层。至GD15.5时部分实验组腭突中嵴上皮仍然存在,不能及时消退,导致两侧腭突间充质组织无法相互贯通,形成腭裂。
第二部分 C57BL/6N小鼠体外胚胎腭器官培养模型的建立及atRA致畸机制的研究
方法:
1.胚胎腭器官体外培养在C57BL/6N孕鼠GD14.5时处死,无菌条件下解剖出胎鼠。在体视显微镜下,用显微外科器械从口裂至耳屏前水平切开,以显微镊去除下颌、舌体及后脑组织,充分暴露胎鼠腭突。再平行上述切口,在眼裂水平切开,去除脑组织。剪除侧腭突后缘多余组织。获得面部中间体,置于消毒好的微孔滤膜上,一同转至金属格栅表面。添加BGJb培养液至胚胎腭板水平。水平转移培养皿至CO2培养箱中培养。
2.在胚胎腭器官体外培养开始阶段即向培养体系内添加atRA至终浓度为3.0μM,空白对照组加入相应剂量的乙醇溶液。
3.吖啶橙染色观察胚胎腭器官体外培养效果。
4.TUNNEL染色方法检测体外培养胚胎腭中嵴上皮细胞凋亡。
5.免疫组化检测体外培养胚胎腭组织内Smad2/3表达。
结果:
1.本研究采用GD14.5胚胎所获得的胚胎腭突进行体外培养。在体外培养24h后,82.30%的腭突可以实现接触,逐步完全融合,与体内发育过程基本一致。
2.胚胎腭突进行体外培养过程中,在腭突中嵴上皮接触部位出现凋亡集中区。
3.在胚胎腭器官体外培养中加入终浓度为3.0μM的atRA,胚胎腭器官在体外培养24小时后仍未能融合,腭突中嵴上皮持续存在。
4.体外培养24小时的对照组腭突,中嵴上皮内Smad2/3呈阳性表达。
第三部分 atRA对C57BL/6N小鼠胚胎腭间充质细胞周期分布的影响及其作用机制的研究
方法:
1.流式细胞术检测胚胎腭间充质细胞周期采用上述方法制造不同类型的腭裂动物模型,解剖获得胚胎腭突。
2.BrdU和Ki67免疫组化检测胚胎腭间充质细胞周期。
3.Real—Time RT—PCR检测p21和pRb的mRNA在小鼠胚胎腭突间充质中的表达。
4.Western Blot检测周期蛋白p21和pRb在小鼠胚胎腭突间充质中的表达。
结果:
1.流式细胞术检测发现,GD10的atRA处理使胚胎腭间充质细胞周期阻滞在G0-G1期。而GD12给予C57BL/6N孕鼠atRA并不会影响胚胎腭间充质细胞周期分布。
2.免疫组化检测发现,Ki67无论是在GD10给予atRA组还是GD12给予atRA组,阳性结果均与各自相应的对照组之间没有显著性差异。
3.通过Quantity RT-PCR、Western Blot等手段检测胚胎腭中pRb在mRNA及蛋白水平的表达情况。发现在GD10给予atRA组pRb的mRNA和蛋白的相对表达量均显著降低。
4.在对p21的mRNA及蛋白相对表达量检测中发现:GD10给予atRA可以诱导鼠胚胎腭间充质细胞在特定时期出现p21mRNA及蛋白表达水平的变化,其变化趋势与前期细胞周期变化趋势基本一致,而在GD12给予atRA组及其相应对照组之间则未发现此现象。
第四部分 RNA干扰原代培养胚胎腭间充质细胞Smad2/3基因对atRA阻滞细胞周期作用的影响
方法:
1.Real-Time RT-PCR检测Smad2和Smad3在胎鼠腭突间充质中的mRNA表达水平。
2.Western Blot检测Smad2/3、pSmad2和pSmad3在胎鼠腭突间充质中的蛋白表达水平。
3.C57BL/6N胎鼠腭突间充质细胞的分离与培养在GD14.5处死C57BL/6N孕鼠,无菌条件下解剖获得胚胎腭突,1 U/ml dispaseⅡ酶处理后去除上皮,将剩余组织解离至单细胞悬液,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,置于CO2培养箱中培养。
4.MTT法检测原代培养的腭突间充质细胞增殖情况。
5.RNA干扰原代培养胚胎腭间充质细胞Smad2/3基因,Western Blot检测Smad2/3、pSmad2、pSmad3和p21在RNA干扰后的胎鼠腭突间充质细胞中的蛋白表达水平。
6.流式细胞术检测RNA干扰后的胎鼠腭突间充质细胞周期分布。
结果:
1.通过Quantity RT—PCR、Western blotting等手段检测胚胎腭中Smad2和Smad3在mRNA及蛋白水平的表达情况。
2.成功分离并鉴定原代培养C57BL/6N胎鼠腭突间充质细胞。
3.Western Blot检测结果的灰度分析证实:在空白对照组和阴性对照组中,Smad2/3蛋白的相对表达量没有差异,而加入Smad2/3 siRNA的胎鼠腭突间充质细胞的Smad2/3蛋白的表达水平相对空白对照组显著降低,敲减效率为79.70%。
4.检测Smad2/3 siRNA处理+atRA处理组中Smad2/3的蛋白表达水平,相对Control siRNA+atRA处理组显著下降。而该组中p21的表达水平也同样出现下降。
5.给予3.0μM atRA处理48小时的阴性对照组细胞与不加atRA的阴性对照组细胞相比较,前者的G0/G1期细胞比例显著增高,相应S期细胞比例显著下调。
结论:
1.本研究成功建立atRA诱导的不同类型的C57BL/6N胎鼠腭裂模型。
2.本研究成功建立胚胎腭器官体外培养模型。通过体外培养基本可以重复体内双侧腭突接触融合过程。体外培养的融合率达到82.30%。
3.通过体外胚胎腭器官培养证实,双侧腭突接触可以诱发腭突中嵴上皮发生凋亡,而不接触则不会引起凋亡。
4.在C57BL/6N孕鼠妊娠第10天给予atRA灌胃,可以诱导胎鼠胚胎腭间充质细胞出现细胞周期G1期阻滞,导致细胞数量下降,胚胎腭发育受阻,形成小腭突腭裂。
5.在C57BL/6N孕鼠妊娠第10天给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭间充质内pRb的mRNA及蛋白相对表达量出现下降,导致胚胎腭间充质细胞无法通过G1/S限制点,出现G1期阻滞。
6.在C57BL/6N孕鼠妊娠第10天给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭间充质内p21的mRNA及蛋白相对表达量出现增高,对G1/S限制点发挥负性调节作用,导致胚胎腭间充质细胞出现G1期阻滞。
7.在C57BL/6N孕鼠妊娠第10天给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭间充质内Smadz和Smad3的mRNA相对表达量出现增高。
8.成功体外原代培养C57BL/6N胎鼠腭突问充质细胞。
9.采用RNAi的方法成功干扰体外原代培养的C57BL/6N胎鼠腭突间充质细胞中Smad2/3基因的表达,干扰效率约为80%。
10.证实Smad2/3通过p21参与了atRA诱导的胚胎腭突间充质细胞G1期阻滞现象。