背景 人乳头瘤病毒(HPVs)是一种小的DNA肿瘤病毒，它可以感染上皮细胞，引起细胞的增生性病变。大量的体内外的流行病学研究显示，某些特异的HPV感染可以导致上皮细胞的恶性变。90％以上的宫颈癌HPV阳性。大多数这些病变是粘膜相关的高危HPV亚型所致。HPV感染是宫颈癌最主要的致病因素，E6是主要的致癌基因之一，高危HPV基因型，如HPV16的E6蛋白表达水平是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。近年来，一种被称为核酶的新的遗传学工具被发现。核酶是一种具有催化活性的RNA分子，它不仅具有反义核酸与靶RNA特异性结合的功能，同时具有酶的催化特征，可以特异性地切割靶RNA分子。放射治疗是目前宫颈癌治疗的标准和有效的方法；化疗作为一种辅助治疗手段近年来越来越受到重视。将基因治疗、放疗、化疗相结合为宫颈癌的治疗提供了一个新的研究思路和方法。 目的 本研究通过脂质体法将抗HPV16E6核酶(ribozyme)转染入宫颈癌CaSKi细胞，研究该核酶对宫颈癌CaSKi细胞的恶性表型、端粒酶活性和放化疗敏感性的影响和基因调控机制，旨在探讨HPV的致癌机制，寻找一种有效的核酶与放、化疗相结合的宫颈癌治疗方法。 方法 1．以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞，分 第一军医人学博士学位论文别命名为CaSKi－R、CaSKiP细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达，Northern杂交检测H种细胞中E6基因的表达。2．观察了三种细胞的形态，测定三种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率，流式细胞仪检测了三种细胞的细胞周期变化。3．用TRAP七LISA法定量检测了三种细胞的端粒酶活性，流式细胞术和RT－PCR检观了p53、c－myc、bclZ基因和蛋白的表达。4．采用MTT比色法和克隆形成试验检测了在体外放化疗对三种细胞的细胞毒作用，抗 HPV 6E6核酶对宫颈癌细胞放化疗敏感性的影响；裸鼠移植瘤生长分析检测了三种细胞在裸鼠体内对化疗药物顺铂敏感性。5．Annexine叩I双标法、细胞总DNA琼脂糖凝胶电泳检测三种细胞处理前和放化疗后凋亡率的变化，透射电镜观察了三种细胞在X线照射后和顺铂处理后的超微结构改变。6、用流式细胞术和 western blot法分别检测了三种宫颈癌细胞放化疗前后的bCI－2、P53、b狐、C－myC、CCpase3蛋白表达。RT－PCR法检现了三子细胞bclZ、p53、bax、c－myc、hTR、hTERT基因表达。结果1．用脂质体法将抗HPV16E6核酶转染入宫颈癌CaSKi细胞后，用点杂交证实核酶能在 CaSKiK细胞中稳定表达。用 N。them blot、流式仪和western blot法证实CaSKi．R细胞的HPV16E6的表达量较CaSKi－P、CaSKi细胞明显降低。2．三种细胞的形态没有明显差异；CaSKiP、CaSKi细胞比较，CaSKIR细胞生长速度较明显减慢，软琼脂克隆形成率显著降低。3．CaSKiE细胞较CaSKiP、CaSKi细胞的端粒酶活性明显降低，p53蛋白表达增加，bclZ、c－myc蛋白表达减少；p53、hTR mRNA在三种细胞中表达无差异，CaSXi－R细胞较CaSKiI、CaSKi细胞的hTERT、be12、c－mvc mRNA表达减少。4．X线照射后可以诱导三种宫颈癌细胞变圆，贴壁能力逐渐消失，细胞体积变小，细胞核浓缩。与CaSKi－P、CaSKi细胞相比，CaSKi－R细胞变化更明显。X线照射后三种细胞都出现明显的生长抑制，随着X线照射 o一 第一军医大学博士学位论文 剂量的增加和照射的培养时间的延长，对三种细胞的抑制率逐渐增加， 在各个照射剂量，射线对CaSKi－R细胞的抑制率都较CaSKi－P。CaSKi细 胞明显增加。与CaSKi－P、CaSKi细胞相比，在X线照射前后CaSKi干细 胞的克隆形成率明显减少，而凋亡率明显增加。CaSKi干细胞对射线的 敏感性较CaSKi－P、CaSKi细胞明显增加。 透射电镜观察CaSKi于细胞经X射线辐射后，大部分细胞凋亡； CaSKi－P、CaSKi细胞只见少部分细胞凋亡，调亡细胞胞核明显浓缩，染 色质凝聚可见凋亡小体形成。 CaSKIR细胞p53、bax蛋白表达率较CaSKi、CaSKiP的表达率明 显增高，而CaSKi《细胞bclZ、c－myc蛋白的表达较CaSKi、CaSKi干 的阳性率明显下降，p53、bax、hcf上和c－m印的表达阳性率在CaSKi。 CaSKi十间无显著差异。经 X线照射后 CaSKi报在分子量 3．2 X 104及 2 XIO‘处均可检测到蛋白条带而 CaSKi和 CaSKiF仅在分子量 3．2 XIO‘ 处出现蛋白条带，表明caspase3已被剪切为20Kda的有活性的蛋白酶。 与 CaSKi和 CaSKi－P相比，X线照射后 CaSKi－R细胞表达 p53 mRNA、 bax mRNA明显增加，be12、c－myc mRNA的表达量明显减少，而CaSKi 和 CaSKi干细胞表达的的3、bax、bclZ、c－myc mRNA无差异。 5．10种化疗药物对三种宫颈癌细胞均有一定的抑制作用，?