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SCNT(体细胞核移植技术)是现代生物技术的一项关键技术,在家畜优良个体扩繁、转基因技术以及生物制药等方面已广泛应用。然而,目前体细胞核移植因为不完全重编程等因素,克隆动物出生效率低,异常发育个体比例较高,影响SCNT技术的进一步发展,提高核移植重编程效率和促进核移植胚胎的正常发育是目前生物繁殖领域研究的一个热点问题。大量的报道显示,microRNAs在SCNT胚胎早期发育过程中有不可忽略的功能。mi R-101是在牛体细胞和卵母细胞中均高表达的一种miRNA,在癌细胞中miR-101主要调控细胞的凋亡与增殖,而在牛胚胎发育中作用目前还不清楚。为此,本研究以牛皮肤成纤维细胞为研究对象,利用荧光素酶报告分析(Luciferase Reporter assay)和免疫印迹(Western blot)方法验证了miR-101的一个靶基因ING3;用实时定量PCR(Real time PCR)和流式细胞分析(Flow cytometry)等方法研究了miR-101及其靶基因在牛SCNT供核细胞中的作用;最后评估了miR-101对体细胞核移植胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚质量的影响。得到了以下研究结果:1、扩增miR-101对应的脱氧核酸序列和包含预测靶基因种子序列的片段分别插入到PCDH-513-B1过表达载体和PsiCHECKTM-2报告载体的多克隆位点,构建mi R-101-513-B1过表达载体和WT-ING3-PsiCHECKTM-2报告载体,用重叠延伸PCR的方法扩增得到预测靶基因种子序列突变序列,连接到PsiCHECKTM-2报告载体上,得到MUT-ING3-PsiCHECKTM-2报告载体,测序结果表明与预期一致。用上述重组质粒分组共转染293T细胞系(人肾上皮细胞系),荧光素酶报告实验分析miR-101与ING3的3’UTR种子序列的结合作用。表明,miR-101直接靶向作用于ING3的3’UTR序列。瞬时转染miR-101-513-B1于牛成纤维细胞(PCDH-513-B1空载体作为对照),Western blot检测发现,mi R-101可以抑制牛成纤维细胞中ING3蛋白的表达。2、稳定转染筛选了整合miR-101牛成纤维克隆细胞(miR-101-BFF)和空载体(PCDH-513-B1)牛成纤维克隆细胞(513-B1-BFF),利用实时定量PCR、流式分析和细胞增殖曲线测定的方法检测了miR-101和ING3在牛成纤维细胞中的功能。发现mi R-101不仅抑制ING3基因转录水平的表达,同时也抑制相关基因P53、P21、UHRF1、BAX和DNMT3A的表达;流式细胞分析可知miR-101抑制了细胞的凋亡,同时缩短了细胞周期;细胞增殖曲线分析结果显示miR-101-BFF增殖最快,与流式分析结果一致。3、为进一步研究miR-101对SCNT胚胎发育的影响,本研究以miR-101-BFF为试验供核细胞,以513-B1-BFF为对照供核细胞进行体细胞核移植,检测胚胎发育到第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果显示miR-101-BFF组的囊胚率(35.75%)高于对照组(26.06%)(P<0.05);通过细胞凋亡染色检测,发现miR-101-BFF组的囊胚凋亡率低于对照组(P<0.05);实时定量PCR检测胚胎发育相关基因的表达,结果表明,OCT4和SOX2基因的表达量在miR-101-BFF试验高于均照组(P<0.05)。