1-磷酸-鞘氨醇(Sphingosine1-Phosphate S1P)是一种具有重要生物学活性的溶血磷脂,是一个在细胞生存,生长,分化,迁移等多个生物学过程中起到关键作用的信号分子。S1P是由鞘氨醇激酶(Sphk)催化鞘氨醇(Sphingosine,Sph)磷酸化而形成的,而神经酰氨(Ceramide,Cer)在神经酰胺酶(Ceramidase)的催化下去酰基产生鞘氨醇。Sphk有二种亚型,Sphk1和Sphk2。大量的研究显示Sphk1在肿瘤发生发展中的具有重要作用。已知Cer,Sph与S1P的作用相反,S1P能够促进细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,而Cer,Sph则抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡。Cer,Sph与S1P的代谢在肿瘤中通常是异常的。S1P一方面通过自分泌与旁分泌的方式与G-蛋白偶联的S1P受体1-5结合,另一方面通过细胞内第二信使途径而调节细胞的上述功能。神经脊细胞是一种多能性胚胎干细胞,是包括感觉神经节在内的多种组织的起源细胞。感觉神经节包括脊神经节及脑神经节,它们将痛觉,机械刺激,本体感觉从周围靶点传递到高级躯体感觉中枢。对于神经脊细胞迁移到固定地点并开始增殖分化成感觉神经元及神经胶质细胞的基因调控机制至今还知之甚少。为了筛选与感觉神经节发生相关的候选基因,通过cDNA宏阵列对比迁移早期的神经脊细胞与迁移晚期开始增殖分化的神经脊细胞的基因差异性表达,我们发现了一系列涉及不同基因路径的基因在神经脊细胞停止迁移后表达上调,Sphk1是其中之一。Sphk1是催化S1P生成的关键酶,由此推测S1P信号在胚胎感觉神经节的发育中应该具有一定的作用。　　 研究目的：　　 本研究通过检测SphK1,SphK2以及S1P受体1-5在野生小鼠胚胎发育过程中的表达,特别是在神经系统发育过程中的表达,以确定它们表达的具体部位和所表达的细胞类型。通过敲除小鼠Sphk1和Sphk2基因,以探讨S1P在胚胎发育特别是感觉神经节发生中的作用,并进一步明确S1P在感觉神经节发育中的作用途径。　　 材料与方法:　　 1、通过整体胚胎、组织切片原位杂交及免疫荧光的方法检测SphK1,SphK2,S1P受体1-5在野生小鼠胚胎发育过程中的表达。　　 2、通过基因打靶的方法敲除小鼠Sphk1和Sphk2基因使S1P水平降低到最低限度,以探讨S1P在胚胎发育特别是感觉神经节发生中的作用。　　 结果:　　 1、Sphk1和Sphk2原位杂交结果显示Sphk1在感觉神经发育早期的神经前体细胞中特异性表达,并且随着胚胎的发育,部分神经细胞也开始表达Sphk1。Sphk2在同阶段的感觉神经节中则无明显表达。　　 2、Sphk1和Sphk2基因敲除结果显示单独敲除它们中的任何一个基因,小鼠寿命正常,主要器官的组织学分析没有发现与野生型有明显差异。说明Sphk1和Sphk2之间的功能是互补的。为了把S1P水平控制在极低或零的水平,进一步联合敲除Sphk1和Sphk2基因。结果发现Sphk1和Sphk2基因联合敲除小鼠胚胎不能存活超过E12.5天。在E10.5天和E11.5天发现不同程度的感觉神经节发育缺陷。脊神经节和三叉神经节较小,神经元形态不整,排列紊乱。用免疫荧光标记SOXlO阳性的神经前体细胞,Islet1/2阳性的已分化的神经细胞,Active-Caspase3阳性的凋亡细胞,和Phospho-histoneH3阳性的分裂期细胞。结果显示E10.5天,Sphk1和Sphk2基因双敲除小鼠脊神经节神经细胞数显著减少,而神经前体细胞无明显改变,E11.5天,Sphkl和Sphk2基因联合敲除小鼠三叉神经节和脊神经节内的神经前体细胞及神经细胞数量显著性减少,细胞数的减少是由于凋亡细胞增加,增殖细胞减少而导致的。神经前体细胞和神经细胞都经历细胞凋亡的过程。在Sphk1和Sphk2基因联合敲除小鼠的S1P接近于0的同时,Cer和Sph的水平都有所下降,但是与野生型胚胎比较Cer/S1P和Sph/S1P的比值成千倍的增高。可见Cer,Sph与S1P的比例严重失衡,导致细胞凋亡凸显。　　 3、S1P受体1-5原位杂交结果显示S1pr2在迁移中的脑部神经脊细胞和神经脊细胞来源的肠神经节细胞表达。S1pr1,Slpr4,S1pr5在胚胎发育过程中特别是发育晚期的神经上皮和/或神经节内细胞都有一定程度的表达。S1pr3主要表达于围绕神经结构的非神经组织。没有发现S1P五种受体中的任何一种在感觉神经节发育的早期有特异性的表达。　　 结论:　　 1、Sphk1在脊神经节和三叉神经节早期发育过程中的神经前体细胞和神经细胞特异性表达。　　 2、S1P缺失导致小鼠的感觉神经节的发育缺陷,其作用是通过促进感觉神经节内神经前体细胞和神经细胞凋亡,并且抑制神经前体细胞增殖而实现的。　　 3、S1P在感觉神经节发育中的作用是通过细胞内第二信使,而不是细胞表面受体的途径而实现的。