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目的:恶性肿瘤正严重威胁着人类的健康,近年来其发病率和死亡率均呈现出持续上升的态势,急需更加快速精准的诊断技术来指导靶向治疗方案。相较于传统的放疗化疗,靶向治疗具备特异性强、毒副作用低等优势。当前药物治疗的靶向性逐步提升,对多种恶性肿瘤具有显著疗效,针对特有的基因突变对应不同的用药策略,已在临床中逐渐普及,如何快速简便地进行基因突变检测是使患者得到及时治疗的关键。基于扩增和荧光信号的传统核酸检测方法需要昂贵的试剂、笨重的仪器以及专业的操作人员,而且每次试验都很耗时,患者往往需要到省一级的大型医院进行采样检测,样品还将被送至专门的医学检验机构进行测序和生信分析,需要20天左右得到检测结果,医疗的可及性难以得到满足。本论文研究了一种基于多孔阳极氧化铝（PAA）的传感芯片,旨在立足药学学科开展针对医疗卫生以及各类核酸相关疾病的伴随诊断。该芯片经过多步改性修饰,再由失活Cas9（dCas9）蛋白和与靶向序列特异性结合的引导RNA（sg RNA）修饰,最后结合电化学离子电流整流（ICR）的原理进行电信号的测量,这种首次被开发的系统我们将其命名为CRISPR-PAA。方法:CRISPR-PAA平台的检测原理是基于表面多步改性后的PAA芯片分别结合CRISPR/dCas9系统的dCas9蛋白、特异性结合靶向序列的sg RNA以及包括病毒或单碱基突变临床样本全基因组在内的靶向序列,通过电化学技术利用ICR的原理,由于不对称的离子迁移得到非线性电流电势（I-V）曲线,针对修饰后的PAA芯片进行电信号检测。电信号的改变是由于核酸结合后的芯片带有负电,在电极缓冲液中会引起芯片两侧K+离子传输效率以及电势的变化,使检测到的电流值明显增强,能够直观高效的体现出靶向序列的结合状态,进而达到特异性检测和即时诊断的目的。第一部分研究为制备浓度纯度达到检测平台要求的dCas9蛋白,通过构建dCas9蛋白表达载体,小试表达筛选出最适合的表达条件,之后进行中试发酵扩大培养以及纯化最终得到dCas9蛋白,并验证蛋白相关参数是否达到标准。第二部分研究为系统所需PAA芯片的制备步骤,将高纯铝片在适当温度下经热处理后,在酸性溶液中经两步阳极氧化操作和去膜抛光等处理得到均匀的Al2O3多孔薄膜。第三部分研究为核酸检测平台的搭建与验证,通过SEM电镜以及X射线光电子能谱（XPS）对改性修饰后的PAA芯片进行表征,并且筛选出系统所需最适合的电极缓冲液浓度和p H值。通过对确定结合活性的大肠杆菌标准序列和新冠病毒S基因,N基因以及ORF1ab基因进行系统稳定性验证。第四部分研究为针对临床样本单碱基突变的检测验证,通过对大B细胞淋巴瘤患者手术样本提取全基因组DNA进行检测。针对单碱基突变MYD88L265P设计特异性sg RNA,确定结合活性并对比传统检测方法q RT-PCR和Sanger测序进一步验证CRISPR-PAA电化学核酸检测平台的稳定性和可行性。结果:成功开发并验证了一种CRISPR-PAA电化学核酸检测平台。通过电极缓冲液中K+离子传输效率以及电势的改变,直接反映出大肠杆菌标准序列、新冠病毒相关基因以及肿瘤单碱基突变样本全基因组序列的结合效率。得到了纯度浓度均较高的适用于检测平台的dCas9蛋白、成功验证了PAA芯片的表面改性效果并且针对不同靶向序列得到了令人满意的检测效果。第一部分研究中成功构建了dCas9蛋白大肠杆菌表达载体,小试表达筛选得到最适表达条件为:IPTG浓度:1 m M;诱导时间:8 h;诱导温度:16℃。发酵纯化后蛋白浓度达到1.34 mg/m L,纯度为98.1%。第二部分研究,通过两步电化学阳极氧化,刻蚀操作是在磷酸/铬酸混合酸溶液中进行,铝及其上的有序凹坑都得以完整保留,极大地简化了制备过程。有效感应区域确定在一个直径为0.5 mm的圆膜,最终得到适配临床核酸检测的可修饰PAA芯片。第三部分研究,使用XPS方法以及SEM电镜对改性修饰后的PAA芯片进行表征,确认每一步修饰后的元素变化证明修饰方法的稳定性和可行性。扫描电镜分别对比空白芯片和dCas9蛋白修饰后的形貌变化,俯视图和截面图显示蛋白和芯片结合良好。确定了在电解液KCl浓度为5 m M,p H=7.6的条件下检测值更稳定。系统针对大肠杆菌标准序列以及新冠病毒S基因,N基因以及ORF1ab基因的检测验证效果良好。首先通过DNA结合反应验证了体系的结合活性,设置加入DNA浓度梯度比较电流值,检测电流最高可达250μA以上,说明该系统具备灵敏高效的特点。第四部分研究,针对13例临床样本全基因组DNA及其MYD88L265P突变位点设计了特异性引物和sg RNA,完成了MYD88L265P特异性鉴定及sg RNA活性验证。通过计算得到检测限为26.3 f M,证明了检测平台具备极高的灵敏度。对比传统的q PCR和Sanger测序方法,CRISPR-PAA电化学系统的特异性和实用性得到了进一步验证。结论:通过CRISPR/dCas9技术和电化学检测方法相结合,开发并验证了一种CRISPR-PAA电化学核酸检测平台。通过对已知序列、新冠病毒序列以及临床样本单碱基突变序列的检测,进一步验证了平台的有效性和实用性,将为基于基因组或肿瘤SNV的诊断和即时治疗提供易于操作、特异性强、具备医疗可及性且高效的检测解决方案。