白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)是从植物白芍根部中所提取的主要有效成分,TGP是第一个来源于植物并作为抗炎免疫调节药上市的抗类风湿药物,不仅用于改善关节炎患者的症状,而且在长期临床用药过程中患者出现的不良反应较少,无明显的毒副作用。然而TGP起效缓慢限制其临床应用,分析可能原因是TGP中含量最多的活性成分芍药苷(paeoniflorin, Pae)口服吸收较差,而这可能与Pae化学结构中含有多个亲水性的羟基有关,其脂溶性较差。因此,课题组前期为了提高脂溶性,以Pae作为先导化合物,对其进行芳香酸酯化修饰得到创新性药物苯磺酰芍药苷(benzenesulfonyl paeoniflorin, CP-25),研究发现CP-25具有良好的抗炎及免疫调节活性,而CP-25的血浆蛋白结合率及大鼠体内的代谢和排泄特点尚不清楚,有待于进一步研究。乙酰化反应产物可以明显提高药物的脂溶性,以改善药物的吸收和细胞通透性,其生物活性明显高于原药,同时乙酰化产物是体内的内源性物质,具有低毒性,相对安全,且脂肪酸酯化修饰产物也未做研究。因此,本课题的研究内容：考察CP-25最优合成工艺,提高产率；考察CP-25的血浆蛋白结合率、排泄和代谢过程；探索CP-25的类似物单乙酰芍药苷(6’-acetylpaeoniflorin,6-AP)的合成,药代动力学过程及抗炎、免疫调节活性。目的：通过单因素试验确定主要影响因素,进行正交设计试验,确定CP-25的最优合成工艺,以达到符合工业化生产的要求。以开发CP-25为优良抗炎免疫调节药物为目的,对其血浆蛋白结合率、体内代谢及排泄过程进行研究,揭示CP-25的体内过程。通过乙酰化反应合成6-AP,并对其大鼠灌胃后的药代动力学特征及抗炎免疫活性进行初步探索,并与Pae进行比较。方法：1.采用Pae、苯磺酰氯为合成原料,选择吡啶作为缚酸剂,选择4-二甲氨基毗啶(DMAP)作为催化剂,三氯甲烷作为溶剂,合成CP-25。通过单因素试验考察反应物的物料摩尔比、催化剂用量、缚酸剂用量、反应温度、溶剂用量及反应时间对CP-25产率的影响,并根据单因素试验结果,进行正交试验设计,优化出最终的最佳合成工艺条件。2.建立CP-25和Pae的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)定量分析方法,采用超滤法(ultrafiltration)测定CP-25和Pae的血浆蛋白结合率并进行比较；对CP-25与不同种属间(大鼠、犬和人)血浆蛋白结合率进行测定并比较；考察CP-25与抗炎免疫调节药物联合应用后,其血浆蛋白结合率所发生的变化。3.建立大鼠尿液、粪便和胆汁中CP-25的HPLC定量分析方法,大鼠灌胃给予CP-25混悬液后,收集不同时间段大鼠的尿液、粪便和胆汁,检测尿液、粪便和胆汁中CP-25的情况。4.采用超高效液相色谱-电喷雾离子源-质谱串联法(ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC)-electrospray ionization (ESI)-MS/MS)技术,建立信息依赖扫描Information-Dependent Acquisition(IDA)-UHPLC-ESI-MS/MS方法,大鼠灌胃给予CP-25混悬液后,收集不同时间段大鼠的血浆、尿液、粪便和胆汁,检测CP-25的代谢产物。5.以Pae和乙酸酐为合成原料,经乙酰化反应合成6-AP,并经1H-NMR, 13C-NMR进行结构确证；建立大鼠血浆中6-AP和Pae的HPLC定量分析方法,大鼠灌胃给予CP-25溶液后,对6-AP和Pae在大鼠体内的药动学参数进行比较；建立小鼠变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)模型,观察6-AP和Pae对小鼠耳片肿胀度、脾脏指数、组织病理学、T细胞增殖、白细胞介素(Interleukin-10, IL-10)和IL-17的含量水平的影响。结果：1.单因素试验结果显示,对CP-25收率影响较大的因素有：物料摩尔比、缚酸剂用量、溶剂用量及反应时间；正交试验优化确定最佳合成工艺条件为：物料摩尔比1：2、反应时间10 h、缚酸剂用量4 mL和溶剂用量20 mL, CP-25的收率由原来的20%上升到58%。2.(1)CP-25和Pae血浆浓度为20,40和80 μg·mL-1时,CP-25与大鼠血浆的蛋白结合率分别为(93.794±0.31)%、(92.23±0.23)%、(90.66±0.32)%,Pae与大鼠血浆的蛋白结合率分别为(19.86±2.66)%、(19.95±2.13)%、(19.90±0.97)%。(2)CP-25与犬血浆的蛋白结合率分别为(96.00±0.19)%、(95.28±0.41)%、(94.75±0.47)%；与人血浆的蛋白结合率分别为(94.87±0.24)%、(93.624±0.17)%、(93.23±0.21)%。(3)双氯芬酸钠(40 μg·mL-1)可使CP-25(20,40和80 μg·mL-1)的血浆蛋白结合率降低7.90%,6.97%和6.44%,具有显著性差异(P<0.05)；双氯芬酸钠(2000 μg·mL-1)可使CP-25(20,40和80 μg·mL-1)的血浆蛋白结合率降低43.42%,40.01%和37.66%,具有显著性差异(P<0.05)。来氟米特(40 μg·mL-1)可使CP-25(40和80 μg·mL-1)血浆蛋白结合率降低0.37%和0.87%,无显著性差异(P>0.05)；来氟米特(40 μg·mL-1)可使CP-25(20 μg·mL-1)血浆蛋白结合率降低1.95%,具有显著性差异(P<0.05)；来氟米特(400 μg·mL-1)可使CP-25(20,40和80 μg·mL-1)血浆蛋白结合率降低10.88%,9.17%和5.47%,具有显著性差异(P<0.05)。塞来昔布(40 μg·mL-1)可使CP-25(80 μg·mL-1)的血浆蛋白结合率降低0.65%,无显著性差异(P>0.05)；塞来昔布(40μg·mL-1)可使CP-25(20和40 μg·mL-1)血浆蛋白结合率降低3.46%和1.97%,具有显著性差异(P<0.05)；塞来昔布(400 μg·mL-1)可使CP-25(20,40和80 μg·mL-1)血浆蛋白结合率降低11.36%,10.01%和7.21%,具有显著性差异(P<0.05)。3.0-48h内,CP-25在雄性大鼠尿液累积排泄量为22.1861±2.5725μg,占总给药量0.2175±0.0252%,雌性大鼠尿液累积排泄量为13.8342±0.9274μg,占总给药量0.1356±0.0091%。0-96h内,CP-25在雄性大鼠粪便累积排泄量为1923.2050±184.5339μg,占总给药量18.4039±1.7659%,雌性大鼠粪便累积排泄量为1442.3421±276.7033μg,占总给药量14.0442±2.3535%。0-12h内,CP-25在雄性大鼠胆汁累积排泄量为317.8285±8.0204μg,占总给药量3.1894±0.0805%,雌性大鼠胆汁累积排泄量为713.3196±37.7496μg,占总给药量7.1583±0.3788%。均存在雌雄差异(P<0.05)。4.大鼠的血浆、尿液、粪便和胆汁中共发现5个代谢产物,依次命名为M1(单甲基化)、M2(脱苯磺酰基)、M3(脱甲醛)、M4(脱糖基)及M5(双甲基化),并对M1-M5的化学结构进行推测；在血浆中检测到了M1、M2及M3；在尿液中检测到了M2；在粪便中检测到了M2、M4及M5；在胆汁中检测到了M2。5.6-AP的化学结构经1H-NMR和13C-NMR确证。6-AP口服吸收过程属于一级动力学,且6-AP的口服吸收明显高于Pae;6-AP分布半衰期(t1/2α)、消除半衰期(t1/2β)和平均滞留时间(MRT)均明显长于Pae,药时曲线下面积(AUC)及峰浓度(Cmax)均明显高于Pae。6-AP能明显抑制ACD小鼠耳片的慢性炎症,、改善其耳片和脾脏组织病理学,抑制脾脏指数和T细胞增殖；提高淋巴细胞中IL-10的含量,同时降低IL-17的分泌,6-AP的抗炎免疫调节作用明显强于Pae。结论：1.优化后的CP-25合成工艺简便、可靠,产量较大,为CP-25的工业化生产提供了可供选择的方法。2.Pae与大鼠血浆的蛋白结合属低度结合,而CP-25与大鼠血浆蛋白的结合属于高度结合；CP-25与大鼠、犬及正常人血浆的蛋白结合率不同,存在种属差异性;低剂量的来氟米特、塞来昔布对CP-25的血浆蛋白结合率基本不产生影响；而双氯芬酸钠、高剂量来氟米特和塞来昔布使CP-25的血浆蛋白结合率明显降低。3.CP-25在大鼠体内以粪便排泄为主,尿液、粪便和胆汁中的排泄情况具有明显的雌性差异。4.推测CP-25在大鼠体内的代谢途径主要包括甲基化、脱苯磺酰基、脱糖基反应,芍药苷是CP-25在体内的主要形式。5.6-AP是Pae 6’位取代的单乙酰产物；口服吸收明显高于Pae,体内消除明显慢于Pae:6-AP抗炎和免疫调节作用明显强于Pae。