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临床上采用激素替代疗法(hormonereplacementtherapy,HRT)预防和治疗更年期综合征、骨质疏松、心血管疾病、泌尿生殖道萎缩等疾病已经有多年历史。虽然2002年美国妇女健康促进会(womenshealthinitiative，WHI)的一项随机、对照研究结果表明，雌、孕激素联合的激素替代疗法(hormonereplacementtherapy,HRT)和单纯雌激素替代疗法(estrogenreplacementtherapy,ERT)不宜作为绝经后妇女冠心病的一级预防措施，但是，长期流行病学资料显示绝经后妇女心血管疾病，如动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)等疾病的发病率明显增加，提示妇女体内雌激素对心血管系统有保护作用。而且，多年临床治疗结果显示ERT能有效减少心血管疾病的发生率。雌激素对心血管系统的保护作用表现在诸多方面，如对血脂和一些血管活性因子的影响、对心血管壁的直接作用以及对凝血机理等方面的影响。我室以前的研究也证明17β-雌二醇(17β-estradial，E2)可促进内皮细胞的修复，抑制内皮素-1诱导的血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)增殖，抑制兔颈动脉球囊损伤后外膜的增殖，从而发挥其心血管保护作用。ERT的合理运用对于防治心脑血管疾病等老年病及提高生活质量的效应已引起广泛重视，但由于长期应用ERT具有明显的副作用，使ERT的使用受到质疑和限制。流行病学调查研究显示高浓度的雌激素可使子宫内膜及乳腺过度增生，引起子宫内膜癌及乳腺癌。在雌激素的基础上加用孕激素是目前常用的HRT方案，虽然加用孕激素可使子宫内膜癌的发生率下降，但对乳腺癌的发病率没影响。因此，如何保留HRT的有益作用，避免其对乳腺的副作用已经成为研究的热点。选择性雌激素受体调节剂(selectiveestrogenreceptormodulator，SERM)的出现为解决对照组增高(P＜0.05，vscontrol)。Ral(10-7mol/l)，E2(10-8mol/l)，和Ral(10-7mol/l)联合E2(10-8mol/l)结果如图。E2，Ral联合E2抑制磷酸化p42/44MAPK蛋白的表达(P＜0.05，vsAngⅡ)，而Ral没有影响(P＞0.05，vsAngⅡ)。E2和Ral联合E2的抑制作用均能被ICI182780减弱(纯ER抑制剂)
小结：在离体培养的VSMC上，SERMRal和E2联合用药能抑制VSMC的增殖，该作用分别通过JAK/STAT3和Ras/MAPK信号转导途径完成。E2具有相似效应。而单独应用SERMRal抑制VSMC增殖的作用通过JAK/STAT3途径发挥，而不影响Ras/MAPK途径。
第3章SERMRal联合17β-雌二醇对乳腺上皮细胞的作用及其机制本研究重点探讨Ral单独以及与E2联合使用时对HMEC增殖的影响，观察在此过程中ER亚型的参与情况，以及信号途径的作用，为进一步明确SERM对乳腺的作用及其机制提供新的实验依据。离体培养HMEC，制备细胞悬液种板，贴壁后换无血清DMEM，加入不同浓度的Ral或E2。
3.1HMEC的鉴定免疫组织化学染色结果显示，HMEC胞浆中呈黄褐色，表明细胞角蛋白阳性，而胞核呈阴性。免疫组化染色阳性率达90％以上。由于细胞角蛋白是上皮细胞特异性表达的物质，该鉴定表明本研究采用的离体培养人乳腺上皮细胞纯度已经达到培养要求。
3.2Ral，E2，Ral与E2联合使用对于HMEC增殖的影响对照组MTTOD值为0.3080±0.0053，Ral(10-9mol/L～10-5mol/L)不会促进HMEC增殖，OD值分别为0.3180±0.0071，0.3135±0.0092，0.3110±0.0080，0.3070±0.0044，0.2970±0.0061(P＞0.05，vscontrol)。给予Ral(10-7mol/L)60min，3h，8h，16hand24h对HMEC增殖也没有影响，OD值分别为0.3158±0.0026，0.3148±0.0038，0.3143±0.0039，0.3130±0.0042，0.3115±0.0050，0.3098±0.0057(P＞0.05，vscontrol)。而E2浓度依赖、时间依赖地刺激HMEC增殖。给予10-10mol/L-10-6mol/LE2，OD值分别为0.2975±0.0100，0.2973±0.0064，0.3125±0.0066，0.3280±0.0057。给予10-7mol/L和10-6mol/LE2，MTTOD值分别增加(6.49±0.67)％和(17.55±2.01)％(P＜0.05，vscontrol)。给予E230min，60min，3h，8h，16h和24h，OD值分别为0.2994±0.0049，0.3287±0.0045，0.3394±0.0058，0.3394±0.0070，0.3487±0.0079，0.3620±0.0053，在60min，3h，8h，16h和24h时，分别增加(6.72±0.69)％，(10.18±0.99)％，(10.18±1.02)％，(13.22±1.29)％，(17.55±1.81)％(P＜0.05，vscontrol)。而给予10-10mol/L～10-8mol/LE2或者在30min时给予E2OD值无明显改变(P＞0.05，vscontrol)。Ral(10-9mol/L，10-7mol/L，10-5mol/L)联合E2(10-6mol/L)时HMEC增殖情况与对照组比较无显著差异，但可以明显抑制E2(10-6mol/L)引起的HMEC增殖，OD值分别为0.308±0.053，0.3600±0.012，0.2927±0.017，0.2827±0.013，0.2783±0.012，较E2(10-6mol/L)分别减少了(19.14±4.7)％，(21.91±3.6)％，(23.12±3.33)％(P＜0.05，vsE2)。
3.3HMEC中ERα和ERβ表达情况免疫荧光结果显示HMEC中ERβ红色荧光呈阳性表达，且主要位于胞核。而ERα免疫荧光显示仅有微弱的绿色荧光，与阴性对照相比无显著差异，表明HMEC中ERα呈阴性。这表明该研究中离体培养的HMEC存在ERβ而不存在ERα。
3.4Ral，E2，Ral与E2联合使用对于HMEC中STAT3以及磷酸化STAT3蛋白表达的影响
STAT3蛋白表达没有显著变化(P＞0.05，vscontrol)。而单独用Ral不会刺激p-STAT3的表达(P＞0.05，vscontrol)，单独用E2时p-STAT3的表达较增加，(P＜0.05，vscontrol)Ral与E2联合使用均能抑制E2诱导的p-STAT3的表达增加(P＜0.05，vscontrol)，JAK激酶的特异性抑制剂AG490能够部分阻断E2、Ral与E2联合使用时的作用。纯ER抑制剂ICI182780也能够部分阻断其作用。(图3-9)
小结：在离体培养的HMEC上，SERMRal能抑制E2诱导的乳腺导管上皮细胞增殖，该作用通过JAK/STAT3信号转导途径完成，可能通过HMEC上表达的ERβ来实现。
结论1.在实验性动脉粥样硬化家兔模型中，SERMRaloxifene和E2联合及单独用药能改善血脂代谢，减轻实验性动脉粥样硬化家兔主动脉斑块形成。
2.在实验性动脉粥样硬化家兔模型中，单独应用SERMRaloxifene不会刺激乳腺导管上皮细胞增殖。而且SERMRaloxifene能抑制E2诱导的乳腺导管上皮细胞增殖。
3.在离体培养的VSMC上，SERMRaloxifene和E2联合用药能抑制VSMC的增殖，该作用分别通过JAK/STAT3和Ras/MAPK信号转导途径完成。单独应用E2具有相似效应。而单独应用SERMRaloxifene抑制VSMC的增殖通过JAK/STAT3途径发挥，而不影响Ras/MAPK途径。
4.在离体培养的HMEC上，SERMRaloxifene能抑制E2诱导的乳腺导管上皮细胞增殖，该作用通过JAK/STAT3信号转导途径，可能通过HMEC上表达的ERβ来实现。