第一部分跑步锻炼及氟西汀对抑郁症模型小鼠行为学的作用目的:氟西汀是临床上治疗抑郁症的经典药物之一,但存在起效延迟、用药两周内症状加重等问题;而跑步锻炼虽被证实可以预防或缓解抑郁症的发生和发展,但其具体疗效仍存在争议。因此,本研究以CUS抑郁症模型小鼠为实验对象,旨在探讨跑步锻炼及氟西汀对抑郁症的治疗效果并对比二者起效时间,为寻找新的抗抑郁手段提供科学基础。方法:选取4-6周龄的雄性C57BL/6小鼠,适应性喂养1周后进行糖水偏好基线测试,筛除有味觉障碍的小鼠。将余下小鼠随机分为正常对照组(Control group,n=14)、CUS模型组(CUS group,n=119)。实验期间,Control组小鼠正常饲养,5只/笼;CUS组小鼠单笼饲养(孤养)。给予CUS组小鼠为期4周的CUS干预后根据糖水偏好结果筛选出成模小鼠42只,随机分为CUS模型对照组(CUS/STD group,n=14)、CUS模型+跑步组(CUS/RUN group,n=14)以及CUS模型+氟西汀组(CUS/FLX group,n=14)。CUS/RUN组小鼠接受为期4周的跑台跑步锻炼干预:每天10 min,每周5天;跑步的起始速度设定为5 m/min,逐步增加至10 m/min,之后维持10 m/min的速度进行跑步锻炼干预。CUS/FLX组小鼠接受腹腔注射氟西汀干预:生理盐水配制浓度为1mg/ml的氟西汀注射液,给药剂量为10 mg/kg/d,持续给药28天。每周末对各组小鼠进行体重测定及糖水偏好测试;跑步锻炼及氟西汀干预结束后对各组小鼠进行悬尾实验、强迫游泳测试以及旷场测试,并结合糖水偏好实验判定小鼠的抑郁样、焦虑样行为以综合评价两种干预的抗抑郁效果。结果:(1)体重测定结果显示:模型建立期间CUS组小鼠的体重增长显著慢于Control组:从给予应激第二周开始,CUS组小鼠的体重显著性低于Control组(p<0.01);跑步锻炼及腹腔注射氟西汀期间,CUS/STD组、CUS/RUN组及CUS/FLX组小鼠体重均显著性低于Control组(p<0.01),而CUS/RUN组及CUS/FLX组小鼠体重分别与CUS/STD组小鼠相比没有显著性差异。(2)糖水偏好实验结果显示:CUS干预第四周末,CUS组小鼠的糖水偏好百分比显著性低于Control组(p<0.01);跑步锻炼及氟西汀干预第三周末,CUS/RUN组小鼠糖水偏好百分比显著性高于CUS/STD组(p<0.01),而此时CUS/FLX组小鼠糖水偏好百分比与CUS/STD组相比没有显著性差异(p>0.05);至跑步锻炼及氟西汀干预第四周末,CUS/RUN组及CUS/FLX组小鼠糖水偏好百分比均显著性高于CUS/STD组(p<0.05,p<0.05)。(3)强迫游泳及悬尾实验结果显示:CUS/STD组小鼠在强迫游泳及悬尾实验中的不动时间均显著性长于Control组(p<0.01,p<0.01);CUS/RUN组小鼠强迫游泳及悬尾实验的不动时间均较CUS/STD组小鼠显著性减少(p<0.05,p<0.05);CUS/FLX组小鼠悬尾实验中的不动时间较CUS/STD组小鼠显著性减少(p<0.01),而强迫游泳不动时间与CUS/STD组小鼠相比没有显著性差异。(4)旷场实验结果显示:Control组、CUS/STD组、CUS/RUN组及CUS/FLX组小鼠的旷场总评分无显著性差异。结论:(1)跑步锻炼能够显著性改善CUS抑郁症模型小鼠的抑郁样行为,且能够先于经典抗抑郁药物氟西汀产生抗抑郁作用。(2)为期4周的跑步锻炼能够比氟西汀更加全面地改善CUS抑郁症模型小鼠的抑郁样行为。(3)CUS干预可使小鼠体重增长减缓,而跑步锻炼及氟西汀干预不能逆转这种体重增长减缓。(4)本实验中的CUS抑郁症模型小鼠不伴随焦虑样行为改变。第二部分跑步锻炼及氟西汀对抑郁症模型小鼠海马内新生神经元形成及突触可塑性的作用目的:跑步锻炼能够先于经典抗抑郁药物氟西汀产生更全面的抗抑郁作用,但其具体机制尚不明确。因此,本研究旨在探讨跑步锻炼及氟西汀对CUS抑郁症模型小鼠海马内新生神经元及突触可塑性的作用,以明确跑步锻炼先于氟西汀起效的细胞机制。方法:实验动物同第一部分,从给予CUS组小鼠跑步锻炼及氟西汀干预的第一天开始,对各组小鼠进行腹腔注射Brd U:生理盐水配制浓度为10 mg/ml的Brd U溶液,给药剂量为50 mg/kg/d,持续给药11天。跑步锻炼及氟西汀干预第四周末,行为学测试结束后,每组分别随机选取6只小鼠进行4%多聚甲醛灌注固定、分离脑组织。每只小鼠随机选取一侧大脑半球置于梯度浓度的蔗糖水(10%、20%、30%)内脱水,OCT包埋后沿冠状面进行组织切片,制作成厚度为50μm的连续冰冻切片,按照1/5的抽样分数对所有含有海马组织的切片进行等距随机抽样,获得5组含有海马的等距连续切片。每只小鼠随机抽取两组连续切片分别进行DCX(标记未成熟神经元)及SP(标记树突棘)的免疫组织化学染色并运用体视学光学分合法分别对海马DG内DCX+细胞及CA1、CA3区及DG内SP+树突棘进行精确定量研究。每只小鼠再随机抽取两组连续切片分别进行Brd U、Neu N及DCX(Brd U标记增殖的细胞,Neu N标记成熟的神经元)三标以及MAP2(标记树突)的免疫荧光染色:利用激光共聚焦显微镜拍照,并在照片中含海马组织的部分叠加100×100μm2的计数框,每只小鼠的海马随机抽取3-5个计数框计数单位面积内Brd U+及Brd U+/DCX-/Neu N+、Brd U+/DCX+/Neu N-及Brd U-/DCX+/Neu N+的细胞个数;使用NIS-Elements AR Analys 4.2检测各组小鼠海马各亚区内MAP2的荧光强度值。结果:(1)各组小鼠海马DG内DCX+细胞的体视学定量结果:CUS/STD组小鼠海马DG内DCX+细胞数量较Control组小鼠显著增多(p<0.05),而跑步锻炼及氟西汀干预后CUS/RUN组与CUS/FLX组小鼠海马DG内DCX+细胞数量较CUS/STD组小鼠显著性减少(p<0.05,p<0.01)。(2)各组小鼠海马DG内Brd U/DCX/Neu N免疫荧光三标染色结果:Control组、CUS/STD组以及CUS/RUN组小鼠海马DG内的单位面积内Brd U+细胞数量均无显著性差异,仅CUS/FLX组小鼠单位面积内Brd U+细胞数量显著性多于CUS/STD组小鼠(p<0.05)。CUS/STD组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX+/Neu N-细胞数量及Brd U+/DCX+/Neu N-细胞占Brd U+细胞的比例均较Control组小鼠相比显著增加(p<0.05,p<0.01),单位面积内Brd U+/DCX-/Neu N+细胞数量较Control组小鼠显著性减少(p<0.05)、Brd U+/DCX-/Neu N+细胞占Brd U+细胞的比例与Control组小鼠相比没有显著性差异(p=0.054);CUS/RUN组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX+/Neu N-细胞数量及Brd U+/DCX+/Neu N-细胞占Brd U+细胞的比例均较CUS/STD组小鼠显著性减少(p<0.01,p<0.01),单位面积内Brd U+/DCX-/Neu N+细胞数量及Brd U+/DCX-/Neu N+细胞占Brd U+细胞的比例均较CUS/STD组小鼠显著性增多(p<0.05,p<0.05);CUS/FLX组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX+/Neu N-细胞数量及Brd U+/DCX+/Neu N-细胞占Brd U+细胞的比例均较CUS/STD组小鼠显著性减少(p<0.05,p<0.01),而单位面积内Brd U+/DCX-/Neu N+细胞数量及Brd U+/DCX-/Neu N+细胞占Brd U+细胞的比例与CUS/STD组小鼠相比均没有显著性差异。CUS/STD组小鼠海马DG单位面积内Brd U-/DCX+/Neu N+细胞数量与Control组小鼠相比无显著性差异,CUS/RUN组、CUS/FLX组小鼠海马DG单位面积内Brd U-/DCX+/Neu N+细胞数量分别与CUS/STD组小鼠相比也没有显著性差异。(3)各组小鼠海马CA1、CA3区及DG内MAP2+树突的免疫荧光染色结果:CUS/STD组小鼠海马三各亚区内MAP2的荧光强度值均较Control组小鼠显著降低(p<0.05,p<0.05,p<0.01);CUS/RUN组小鼠海马三个亚区内MAP2的荧光强度值均较CUS/STD组小鼠显著升高(p<0.05,p<0.01,p<0.05);与跑步锻炼效果相似,CUS/FLX组小鼠海马三个亚区内MAP2的荧光强度值均较CUS/STD组小鼠显著升高(p<0.05,p<0.05,p<0.05)。(4)各组小鼠海马CA1、CA3区及DG内SP+树突棘的体视学定量结果:CUS/STD组小鼠海马CA1、CA3区及DG内SP+树突棘总数目较Control组小鼠显著减少(p<0.01,p<0.05,p<0.01);CUS/RUN组小鼠海马CA1、CA3区及DG内SP+树突棘总数目均较CUS/STD组小鼠显著增多(p<0.05,p<0.05,p<0.01);CUS/FLX组小鼠海马仅DG内SP+树突棘总数目较CUS/STD组小鼠显著增多(p<0.05),而CA1、CA3区内SP+树突棘总数目与CUS/STD组小鼠相比没有显著性差异。(5)各组小鼠海马内突触相关蛋白表达水平的Western blot检测结果:各组间小鼠海马内PSD95、synaptophysin(SYP)的蛋白表达水平均无显著性差异。结论:(1)CUS抑郁症模型小鼠海马DG内存在新生神经元的成熟障碍。(2)跑步锻炼能够促进CUS抑郁症模型小鼠海马DG内新生神经元的成熟,增加CA1、CA3区及DG内的树突棘突触可塑性;而氟西汀对于CUS抑郁症模型小鼠海马DG内新生神经元成熟的作用弱于跑步锻炼、对于树突棘突触可塑性的改善主要集中于DG内而非CA1、CA3区。(3)跑步锻炼对于CUS抑郁症模型小鼠海马DG内新生神经元成熟及树突棘突触可塑性的积极作用优于氟西汀可能是其先于氟西汀产生更加全面的抗抑郁效果的重要细胞机制之一。第三部分跑步锻炼通过促进海马内新生神经元成熟改善抑郁样行为的机制探讨目的:跑步锻炼已被证实可能是通过促进海马DG内新生神经元的成熟产生抗抑郁作用,且第二部分研究提示跑步锻炼促进新生神经元成熟的作用优于氟西汀治疗,那么跑步锻炼促进海马内新生神经元成熟的具体分子机制是什么呢?已有证据提示海马PGC-1α可能是跑步锻炼抗抑郁作用的关键因子,本研究旨在探讨跑步锻炼是否通过海马PGC-1α产生抗抑郁作用及促进新生神经元成熟,为寻找新的治疗抑郁症的靶点提供实验室依据。方法:首先选取第一部分中Control组、CUS/STD组及CUS/RUN组小鼠断颈处死,于冰上迅速分离出海马组织,随机选取一侧提取海马内的RNA并逆转录为c DNA,利用荧光定量PCR方法检测各组小鼠海马内PGC-1α的m RNA水平的表达情况;另一侧海马按照1:10的质量体积比加入蛋白裂解液,超声匀浆后提取上清液,采用Elisa方法检测海马内PGC-1α蛋白水平的表达情况。然后,进行海马PGC-1α基因沉默相关实验:选取4-6周龄的雄性C57BL/6小鼠65只,适应性喂养后进行糖水基线测试,筛除有味觉障碍的小鼠,将余下小鼠随机分为空病毒对照组(AAV-Control group,n=32)及AAV-PGC-1α组(AAVPGC-1αgroup,n=33)后,备皮切开颅顶皮肤,依据小鼠海马坐标(Bregma:-2.3 mm,L:±1.8 mm,V:-2.0 mm)钻孔并给予AAVControl组小鼠海马注射带有绿色荧光蛋白(GFP)的空质粒腺病毒载体AAV2/9-GFP、给予AAV-PGC-1α组小鼠海马注射带有GFP的沉默PGC-1α基因的腺相关病毒载体AAV2/9-PGC-1α-GFP;注射剂量为每侧海马2μl、注射速度为0.2μl/min;密切观察小鼠术后状态。在病毒稳定表达后,将AAV-Control组小鼠随机分为空病毒+不跑步组(AAVControl/SED group,n=16)及空病毒+跑步组(AAV-Control/RUN group,n=16)、AAV-PGC-1α组小鼠随机分为沉默+不跑步组(AAV-PGC-1α/SED group,n=16)及沉默+跑步组(AAV-PGC-1α/RUN group,n=17),给予AAV-Control/RUN组及AAV-PGC-1α/RUN组小鼠为期4周的跑步锻炼干预(跑步方案同第一部分),AAV-Control/SED组及AAV-PGC-1α/SED组小鼠继续正常饲养。每周末对各组小鼠进行糖水偏好测试;在病毒稳定表达后利用荧光定量PCR检测PGC-1α敲除后海马内PGC-1α的m RNA表达情况;此外,在病毒稳定表达后及跑步锻炼干预结束后对各组小鼠进行悬尾、强迫游泳测试,结合糖水偏好实验结果评价跑步锻炼的抗抑郁效果;最后,取Control组、CUS/STD组及CUS/RUN组小鼠中所提取的基因及蛋白检测样本,利用荧光定量PCR、Western blot及Elisa等方法检测各组小鼠海马内FNDC5及BDNF的基因及蛋白的表达情况,探讨跑步通过PGC-1α促进新生神经元成熟、产生抗抑郁作用的下游机制。结果:(1)跑步锻炼对抑郁症模型小鼠海马内PGC-1α的基因及蛋白表达情况的影响如下:CUS/STD组小鼠海马内PGC-1α的蛋白表达量及基因表达水平较Control组小鼠显著降低(p<0.01,p<0.01)、CUS/RUN组小鼠海马内PGC-1α的蛋白表达量较CUS/STD组小鼠显著升高(p<0.05)。(2)PGC-1α沉默后各组小鼠的检测结果如下:1)荧光定量PCR检测结果显示:AAV-PGC-1α组小鼠海马内m RNA水平显著性低于AAV-Control组小鼠(p<0.05)。2)糖水偏好实验结果显示:在小鼠海马PGC-1α沉默第一周,AAV-Control组小鼠与AAV-PGC-1α组小鼠的糖水偏好百分比无显著性差异;病毒稳定表达后AAV-PGC-1α组小鼠的糖水偏好百分比显著性低于AAV-Control组小鼠(p<0.01);4周跑步锻炼后:AAV-PGC-1α/SED组小鼠糖水偏好百分比仍显著性低于AAV-Control/SED组小鼠(p<0.01);而AAV-PGC-1α/RUN组小鼠糖水偏好百分比显著性低于AAV-Control/RUN组小鼠(p<0.01),且与AAV-PGC-1α/SED组小鼠相比没有显著性差异。3)强迫游泳及悬尾实验结果显示:在病毒稳定表达后(跑步前),AAV-PGC-1α组小鼠FST及TST中不动时间均显著性长于AAVControl组小鼠(p<0.05,p<0.05);在跑步锻炼后,AAV-PGC-1α/RUN组小鼠在FST与TST中的不动时间均显著性长于AAV-Control/RUN组小鼠(p<0.05,p<0.05),而与AAV-PGC-1α/SED组小鼠相比没有显著性差异。4)各组小鼠海马DG内Brd U/DCX/Neu N免疫荧光三标染色结果显示:AAV-PGC-1α/SED组小鼠海马DG单位面积内Brd U+细胞数量较AAV-Control/SED组小鼠显著性减少(p<0.05);AAV-PGC-1α/RUN组小鼠海马DG单位面积内Brd U+细胞数量也较AAV-Control/RUN组小鼠显著性减少(p<0.05),而与AAV-PGC-1α/SED组小鼠相比没有显著性差异。AAV-Control/SED组小鼠海马DG单位面积内DCX+细胞数量与AAV-PGC-1α/SED组小鼠相比没有显著性差异,而AAVControl/RUN组小鼠海马DG单位面积内DCX+细胞数量较AAV-PGC-1α/RUN组小鼠显著性减少(p<0.01)。各组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX+/Neu N-细胞数量虽无显著差异,但AAV-PGC-1α/SED组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX+/Neu N-细胞占Brd U+细胞的比例显著性高于AAV-Control/SED组小鼠(p<0.05),AAV-PGC-1α/RUN组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX+/Neu N-细胞占Brd U+细胞的比例也显著性高于AAV-Control/RUN组小鼠(p<0.01)。AAV-PGC-1α/SED组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX-/Neu N+细胞数量较AAVControl/SED组小鼠显著性减少(p<0.05),AAV-PGC-1α/RUN组小鼠海马DG单位面积内Brd U+/DCX-/Neu N+细胞数量也显著性少于AAV-Control/RUN组小鼠(p<0.05),而与AAV-PGC-1α/SED组小鼠相比没有显著性差异。各组小鼠海马DG单位面积内Brd U-/DCX+/Neu N+细胞数量无显著差异。(3)跑步锻炼对抑郁症模型小鼠海马内FNDC5及BDNF的基因及蛋白表达情况的影响如下:各组间小鼠海马内FNDC5及BDNF的蛋白表达水平均无显著性差异,且海马内FNDC5及BDNF的基因表达水平均无显著性差异。结论:(1)CUS诱导的抑郁模型小鼠海马内PGC-1α蛋白及基因的表达降低;沉默海马内PGC-1α后,小鼠表现出抑郁样症状并伴随海马DG内新生神经元形成障碍。(2)海马内PGC-1α基因沉默后,跑步锻炼的抗抑郁效果及促进新生神经元成熟的作用消失,表明跑步锻炼是通过PGC-1α来促进抑郁症模型小鼠海马内新生神经元的成熟,从而发挥抗抑郁作用。(3)跑步锻炼能够通过上调海马PGC-1α发挥抗抑郁作用,并且促进新生神经元成熟,但该作用可能并非通过激活PGC-1α的下游通路FNDC5/BDNF而实现。