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[研究背景] 男性冠心病的发病率显著高于同年龄组女性。近年来，有关雄激素在男性冠心病发病中的作用逐渐受到了研究者的重视，研究表明，男性冠心病患者服用睾酮能够缓解心绞痛症状，即刻改善运动诱发的心肌缺血；雄激素替代治疗可以有效抑制去势雄兔主动脉粥样硬化；直接舒张犬和兔冠状动脉，快速引起大鼠主动脉舒张。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在动脉粥样硬化的发生过程中起着关键性的作用，有报告显示雄激素能够调节VSMCs的增殖，增加大鼠主动脉VSMCs中血栓素A2受体的表达，增强细胞内Ca2+对去极化刺激的反应。由此，临床试验、动物实验和体外研究均提示雄激素在血管功能调节中起重要作用。 雄激素可以扩散进入靶组织和非靶组织，但它只在雄激素受体（androgen receptors,AR）存在的靶组织细胞中行使其生物学功能，雄激素作用的强弱与细胞内AR含量密切相关，对AR表达调控的研究有重要的生物学意义。以往研究业已证实VSMCs中存在雄激素受体。本实验旨在观察睾酮对VSMCs内AR表达的自身调控，并对其调控机制作初步探讨。 [研究方法] 贴块法培养雄性SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，培养的VSMCs达80％融合时换用无血清DMEM培养液静止24hr，使细胞周期实现同步化（因为AR活性和水平随细胞周期变化，实验以静止的VSMCs为研究对象正是基于这一考虑），然后给以不同药物于1％FBS／DMEM培养液中作用相应时间；当需要给以2种以上药物干预时，睾酮为30min后加入。 分别用细胞裂解和高盐提取法制备细胞质和细胞核抽提物，免疫印迹分析（Western blot）法检测提取物中AR蛋白水平；采用异硫氰酸胍-苯酚一氯仿一步法从培养的VSMCs提取总RNA，Northem印迹分析法检测细胞中AR mRNA水平;采用细胞计数和【3H]一胸腺喀咤掺入法观察调控过程中细胞数量和DNA合成变化情况。 细胞酶提取液的制备:超声破碎细胞，超速离心后分别得到胞浆组分和胞膜组分，进一步经DEAE一cenulose离子交换柱纯化，蛋白激酶A （PKA）和蛋白激酶C（PKC）活性是通过对其底物组蛋白的磷酸化程度来测定。采用三氯乙酸法制备细胞cAMP提取物，放射免疫法测定cAMP含量。【研究结果】一、辜酮对VSMCs中AR表达的调控作用 1.翠酮对VSMCs胞质和胞核中AR蛋白表达量的影响 vsMcs与不同浓度翠酮（04召M）作用24hr，细胞内AR蛋白水平呈剂量依赖性增加。免疫印迹结果显示，与对照组（0.1%无水乙醇）相比，40 nM肇酮刺激能显著上调vsMcs胞质中AR蛋白表达，至4拜M翠酮水平时达对照组水平的20倍;在VSMCs胞核也存在AR的剂量依赖性自身上调作用，且在4 nM辜酮作用时即较对照组有显著增加。 VSMCs与生理水平的翠酮（40 nM）作用不同时间（0一48 hr），细胞内AR蛋白水平呈时间相关性改变。免疫印迹结果显示，40 nM攀酮作用10 min时引起VSMCs胞质AR蛋白水平的短暂下调，继之AR表达量随时间延长而逐渐增加，至48hr时达对照组（0时间点）水平的5倍;而胞核中AR在翠酮作用12 hr后方有显著增加，随观察时间（一48hr）延长亦逐渐增加。翠酮对胞质AR的上调现象提示其对VSMCs功能的调节过程可能有非转录机制的参与;而胞核AR的自身上调作用（即核转位）则提示该受体具有转录激活功能。 2.辜酮对VSMCs中AR mRNA表达水平的影响 不同浓度翠酮与VSMCs作用24hr，细胞内AR mRNA表达水平呈剂量依赖性增加。Northern印迹结果显示，o，4 nM，40 nM，400 nM和4召M各浓度组AR mRNA相对值分别为:53。76士4.84，52.69士7.53，76.88士5.91，95.70士8.06和100.00士10.75:统计学分析结果示，与对照组相比，40 nM一4赵M辜酮能够显著增加AR mRNA表达，显著性水平（尸值）分别为0.047，0.002和0.001。 VSMCs与生理水平的翠酮（40 nM）作用不同时间（0一24hr），细胞内ARmRNA表达水平呈时间相关性改变。Northem印迹结果显示，O，10 min，1 hr，12hr，24 hr各作用时间点AR mRNA相对值分别为:75.19士3.76，72.18士8.27，73.31士6.02， 88.72士4.51，100.00士8.27;经统计分析，与对照组（0时间点）相比，肇酮作用10 min一12h;vSMcs中AR mRNA水平无显著性改变（尸>0.05），24 hr时方能增加AR表达（尸二0.036），辜酮的这种延时性作用提示VSMCs中AR mRNA的自身上调是需要转录过程介导的。 3.转录和翻译抑制剂对VSMCs中AR蛋白自身上调作用的影响 vsMes与mRNA合成抑制剂actinomycinD（A，5拜岁ml）和/或蛋白合成抑制剂eycloheximide（e，10召岁ml）孵育30 min后加入40 nM肇酮作用24hr，分别对VSMCs胞质和胞核提取物进行免疫印迹分析。与单独40 nM皋酮对照组相比，预先给以A、C或A+C能够明显抑制皋酮对VSMCs胞质AR蛋白的上调作用，其平均值分别降至对照组（40 nM翠酮）水平的46%、12%和7%;并能够阻断肇酮对于胞核AR蛋白表达的上调作用。由此提示当有转录和/或翻译抑制剂存在时，VSMCs内AR由胞质向胞核内转运（核转位）行使转录因子的功能明显减弱。 4.AR拮抗剂对VSMCs中AR的自身上调作用的影响 VsMcs与AR拮抗剂氟他胺（Flutamide，4拜M）孵育30 min后加入40 nM翠酮?