【摘 要】
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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的一种禽类烈性传染病。ND的致死率极高,对全球养殖业经济的影响巨大,目前最有效的控制方法仍然是接种疫苗。虽然传统的LaSota弱毒疫苗和我国自主研发的基因Ⅶ型减毒疫苗仍然是我国使用最多的疫苗,但近年来非典型性新城疫的不断爆发,显示出已有疫苗的免疫不足之处,即不能很好的
【基金项目】
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国家重点研发专项（2017YFD0500702）; 江苏省农业科技自主创新项目（编号:CX（19）3008）; 江苏高校“青蓝工程”中青年学术带头人项目; 江苏省优势学科建设项目
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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的一种禽类烈性传染病。ND的致死率极高,对全球养殖业经济的影响巨大,目前最有效的控制方法仍然是接种疫苗。虽然传统的LaSota弱毒疫苗和我国自主研发的基因Ⅶ型减毒疫苗仍然是我国使用最多的疫苗,但近年来非典型性新城疫的不断爆发,显示出已有疫苗的免疫不足之处,即不能很好的抵抗母源抗体的干扰,抗体水平持续时间较短,需要多次免疫接种,增加经济成本并且造成机体应激,减弱疫苗免疫反应。因此急需研制新城疫的新型疫苗来弥补传统疫苗的不足。重组病毒活载体疫苗是新型疫苗研究的突破口,可以实现一针防多病的目的并减少应激反应。在本研究中,利用马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）将其作为活病毒载体构建表达新城疫F蛋白的重组病毒,可以有效的抵抗母源抗体的干扰并达到一针防终身的效果,为新型新城疫疫苗的研究奠定基础。1.表达eGFP基因的重组CVI988马立克氏病病毒的构建本研究中利用eGFP作为报告基因,将其表达盒通过电转化的方式,转入到含有BAC质粒CVI988-Kan-SacB的EL250感受态细胞中,使其发生同源重组替换Kan-SacB基因。通过氯霉素和卡那霉素双抗生素筛选和酶切鉴定得到重组成功的阳性克隆,随后将鉴定正确的BAC质粒转染至CEF细胞,拯救病毒。4-5天后,CEF细胞出现典型MDV感染的细胞病变,将细胞置于荧光显微镜下观察,病变的细胞出现绿色荧光,这表明eGFP成功插入MDV基因组并能在基因组中表达。2.表达NDV-F基因的重组CVI988马立克氏病病毒的构建本研究通过在MDV基因组中插入eGFP,成功得到了表达eGFP的重组病毒,验证了在gpt基因表达位置插入外源基因的可行性,因此可以利用同样的方法在CVI988基因组中插入新城疫的F基因。利用本实验室构建并保存的pcDNA3.1-F质粒,扩增出带有50bp同源重组臂的F基因表达盒,将表达盒转染进CEF细胞后验证了其能在细胞中正常表达。随后以CVI988-Kan-SacB EL250为宿主菌制作感受态细胞,通过电转化将F基因表达盒转入感受态细胞中,使其发生同源重组,替换Kan-SacB基因。培养得到的重组菌经过双抗生素筛选、PCR鉴定和酶切鉴定得到3个重组成功的阳性克隆,进一步转染CEF细胞拯救重组病毒rCVI988-NDV-F。对病毒连续传代15代,每隔5代利用PCR和IFA鉴定重组病毒的遗传稳定性和外源基因的表达。结果显示重组病毒在体外能稳定遗传且外源基因表达稳定。生长特性测定结果显示,与亲本毒株CVI988相比,重组病毒rCVI988-NDV-F在体外的生长复制能力不受影响,最后对NDV-F基因插入位点进行测序鉴定,结果表明其插入位点与预期一致。因此,本研究获得了一株可以在体外CEF细胞内正常生长,稳定表达外源F基因的重组马立克氏病毒。3.重组病毒rCVI988-NDV-F免疫保护效力评价本研究成功构建出表达NDV-F基因的重组马立克氏病病毒rCVI988-NDV-F,并进一步评价其免疫保护效力。将80只I日龄的SPF小鸡随机分为4组,每组20只,攻毒免疫组分别在1日龄接种5000PFU和10000PFU重组病毒,其余两组不做处理。免疫后第2、3、4周采取免疫组和对照组血清样本检测NDV-F特异性抗体水平。结果显示,在免疫后第2周部分鸡逐渐产生抗体,并且随着时间的增加,抗体水平也逐渐升高,第4周时,80%以上的鸡均产生抗体,且抗体水平达到三次检测中最高水平。免疫后第28天,攻毒组和免疫攻毒组的鸡只接种104ELD50新城疫强毒（F48E8毒株）,持续观察14天,攻毒对照组的鸡只死亡率为100%,5000PFU和10000PFU免疫组的保护率分别为90%和100%,结果说明本研究获得的rCVI988-NDV-F对SPF鸡具有良好的免疫保护效力。
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