目的与意义随着人们生活水平的提高,糖尿病发病逐年增加,已发展为继肿瘤、心脑血管疾病之后位居第三位的慢性非传染疾病,由糖尿病引发的多种并发症,不仅给患者的身心健康带来危害,并且造成严重的经济负担。近年来,糖尿病发病出现年轻化、隐蔽化的趋势,并且有进一步流行的趋势。Ⅱ型糖尿病(T2DM)占糖尿病人群总数的90%以上,近年来的研究认为胰岛素抵抗(insulin resistance,ⅠR)是T2DM发病的重要的机制之一,IR是指血液中胰岛素的生物效应降低,胰岛素促进葡萄糖摄取作用受损,导致代偿性胰岛素分泌增多,具体表现为外周组织对胰岛素敏感性下降,以及对葡萄糖的利用障碍。IR强烈预示Ⅱ型糖尿病发生的可能,而且IR将贯穿于Ⅱ型糖尿病发生发展的整个过程,IR越来越得到重视,然而目前为止,西医的角度还没有理想的针对IR的药物,对于IR的治疗多使用胰岛素增敏剂,如噻唑烷二酮类毗格列酮、双胍类二甲双胍；或使用能降糖、改善IR及代谢紊乱的药物；或胰岛素降解抑制剂等,虽然有较好的临床疗效,但西药在治疗中的毒副作用比较大。中医药治疗重视辨证论治,通过整体调节来改善病理状态。虽然在降糖力度和起效时间不及西药,但其有副作用小,可以长期服用等特点,并且其作用往往是多环节,多靶点的调节,中药在促进胰岛素分泌作用,改善胰岛素利用,增加胰岛素敏感性,并在防止并发症上占一定优势,中医药的糖尿病药物筛选成为了研究的新热点。T2DM属于中医的“消渴症”范畴,中医在长期的临床实践中积累了丰富的治疗经验。梅连消渴胶囊来自民间治疗T2DM的常用验方,由黄连、乌梅、附子、干姜、细辛、蜀椒、桂枝、黄柏等12味中药组成,方中黄连与乌梅为君药。黄连性寒味苦,现代药学研究证明其主要成分小檗碱具有改善IR、降糖和纠正脂质代谢紊乱作用,同时降低肝脏糖异生关键酶的活性。梅连消渴胶囊临床应用效果显著,在前期的预实验中证明梅连消渴胶囊有较好的降血糖、改善糖尿病患者临床症状等作用,同时发现梅连消渴胶囊对糖尿病大鼠血清中胰岛素水平有显著影响,但对糖尿病胰岛素抵抗是否有影响?为此提出本项目研究。本次研究目的在于探讨梅连消渴胶囊是否具有调节胰岛素分泌,改善胰岛素抵抗作用,并分别在大鼠、小鼠、细胞建立三种糖尿病模型上进行观察,以探明梅连消渴胶囊调节胰岛素分泌,改善IR作用,阐明梅连消渴胶囊治疗糖尿病的药理机制。实验一梅连消渴胶囊对实验性Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用的影响方法：SD大鼠分为空白对照组(10只)和造模组(110只),空白对照组给与普通饲料,造模组给与高脂高糖饲料,饲养5周后,禁食不禁水12h后腹腔注射(ip)小剂量链脲佐菌素(STZ,30mg-kg-1)造模,正常对照组注射生理盐水,选取72h空腹血糖在7.0-25.0mmo1/L之间的动物进入实验,分组灌胃给药4周。正常对照组和糖尿病模型组灌胃同体积生理盐水。给药期间观察动物一般状态,实验结束时用剪尾法取血测定空腹血糖(FBG)；腹主动脉采血铜离子比色法测定血清游离脂肪酸(FFA)含量；放免法测定血清胰岛素(FINS)水平,计算胰岛素敏感指数(ISI),胰岛素抵抗指数(HMOA-IR);肝脏组织做病理切片HE染色；胰岛组织切片用醛复红染色法计算胰岛组织中p细胞的比例。结果：与正常对照组比较,模型对照组大鼠体重减轻,进食量、饮水量、尿量增加,FBG显著升高(P=0.000,P<0.01),FFA显著升高(P=0.000,P<0.01),FINS显著升高(P=0.000,P<0.01),ISI显著降低(P=0.000,P<0.01),HOMA-IR显著升高(P=0.000,P<0.01),胰岛组织病理显著受损(P=0.000,P<0.01),β细胞所占比例显著降低(P=0.000,P<0.01)。给药四周后,与糖尿病模型组比较,梅连消渴胶囊高剂量组(P=0.001,P<0.01)、中剂量组(P=0.024,P<0.05)显著降低糖尿病大鼠FBG；梅连消渴胶囊高剂量组(P=0.001,P<0.01)、中剂量组(P=0.045,P<0.05)、低剂量组(P=0.011,P<0.05)可显著降低FFA；梅连消渴胶囊高剂量组FINS显著下降(P=0.000,P<0.01)、HOMA-IR显著降低(P=0.003,P<0.01)和ISI显著增强(P=0.000,P<0.01)；中剂量组FINS显著下降(P=0.000,P<0.01),ISI显著增强(P=0.033,P<0.05),HOMA-IR显著降低(P=0.029,P<0.05)；低剂量组FINS显著下降(P=0.005,P<0.01)；梅连消渴胶囊高剂量(P=0.007,P<0.0125)显著改善胰岛组织病理受损；梅连消渴胶囊高剂量组显著提高β细胞比例(P=0.000,P<0.01),中、低剂量有提高β细胞比例的趋势,但无统计学意义。二甲双胍能显著降低糖尿病大鼠FBG(P=0.000,P<0.01),显著改善病理组织受损(P=0.003,P<0.0125),但对FFA、FINS、β细胞比例无显著改善作用。结论：梅连消渴胶囊对Ⅱ型糖尿病大鼠三多一少的临床症状有所改善,显著的改善显著降低模型大鼠的FBG和FINS,显著保护胰岛组织及修复胰岛β细胞的功能,显著的改善模型组大鼠IR状态。实验二梅连消渴胶囊对四氧嘧啶小鼠糖尿病模型胰岛素水平影响方法：雄性KM小鼠,分正常对照组(10只)和造模组(60只),适应性饲养3d,禁食不禁水12h后造模组小鼠尾静脉(iv)注射四氧嘧啶55mg.kg-1进行造模,正常对照组注射同体积的生理盐水。72h后选择空腹血糖水平在10-23mmo1/L的小鼠动物进入实验,分组灌胃给药4周。正常对照组和糖尿病模型组灌胃等容积生理盐水。给药期间观察动物一般状态。实验2w、4w剪尾取血,测定FBG；实验结束时,麻醉摘眼球取血,放免法测定FINS水平。结果：与正常对照组比较,糖尿病模型组小鼠进食量、饮水量、尿量增加,FBG显著性升高(P=0.000,P<0.01),并一直维持在稳定水平,FINS显著降低(P=0.043,P<0.05)。给药四周后,给药组与糖尿病模型组小鼠比较,各给药组均可改善糖尿病小鼠的一般症状,梅连消渴胶囊组FFB降低,但由于标准差过大无统计学意义；消渴丸组小鼠FFA降低,但无统计学意义；二甲双胍组小鼠FFB降低在二周时有统计学意义。梅连消渴胶囊组FINS水平有较大升高,但由于标准差过大无统计学意义；消渴丸组可升高FINS水平,但无统计学意义。结论：梅连消渴胶囊对四氧嘧啶糖尿病小鼠三多一少的临床症状有所改善,可以升高四氧嘧啶小鼠的胰岛素分泌量,提高模型小鼠的胰岛素敏感性。实验三梅连消渴胶囊对HepG2-IR模型葡萄糖消耗量影响方法：HepG2细胞用DMEM培养基在37℃、5%CO2的环境培养,1：3传代。取指数生长期细胞进行实验,调整细胞浓度铺96孔板,分为正常对照组和造模组,造模组细胞置于含高浓度胰岛素的培养基中诱导24h,按照葡萄糖测定试剂盒在全自动生化分析仪上检测细胞培养基中葡萄糖的消耗量,当造模组细胞葡萄糖消耗量显著低于正常对照组时且细胞数量差别不显著时,认为HepG2-IR模型建立,同时考察HepG2-IR模型在48h内的稳定性。MTT实验确定小檗碱及梅连消渴胶囊药液的细胞给药浓度,HepG2细胞作为正常对照组,在给药组HepG2-IR细胞上分别加入含有梅连消渴胶囊药液及梅连消渴胶囊药物血清的培养基,作用24h后培养液换成不合血清的基础培养基培养24h,按照葡萄糖测定试剂盒在全自动生化分析仪上检测培养基中葡萄糖消耗量。结果：与正常对照组HepG2细胞比较,HepG2-IR细胞形态上没有明显差异,HepG2-IR细胞的葡萄糖消耗量显著降低,HepG2-IR细胞模型能稳定存在48h。梅连消渴胶囊药液高剂量组(P=0.005,P<0.01)、中剂量组(P=0.025,P<0.05)能显著的升高HepG2-IR细胞葡萄糖的消耗量；梅连消渴胶囊药物血清15%浓度(P=0.003,P<0.01)、10%浓度(P=0.033,P<0.05)能显著的升高HepG2-IR细胞葡萄糖的消耗量；小檗碱对HepG2-IR细胞葡萄糖的消耗量显著升高。结论：梅连消渴胶囊药液及梅连消渴胶囊药物血清能均显著升高HepG2-IR细胞的葡萄糖消耗量,改善HepG2-IR细胞的IR状态。