[目的]椎间盘退变是引起腰背痛的主要原因,寻找延缓或阻逆椎间盘退变的有效方法被认为是非常有意义的尝试。为此,我们在微创CT引导穿刺建立兔椎间盘退变模型的基础上,将腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)介导的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP1)双基因体外联合转染兔椎间盘髓核细胞后,再将转基因细胞移植于退变兔腰椎间盘内,不同时期分别观察椎间盘信号、椎间高度、Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的变化,以探讨体外延缓或逆转椎间盘细胞退变的方法[方法]63只新西兰大白兔为实验用兔,其中60只应用CT引导下的微创穿刺法建立兔椎间盘退变模型：选择L2-3、L3-4、L4-5椎间盘层面进行CT扫描以穿刺,L1-2、L5-6椎间盘不穿刺作为对照组。以左后方为进针点,测量穿刺角度及深度。消毒后在CT定位下,经皮以18G的穿刺针由右后方穿刺腰椎间盘。穿刺针尖接近纤维环时行CT扫描,调整穿刺角度。刺入髓核腔后再次CT扫描,确定针尖位于髓核中央。造模2周后行MRI扫描以检查椎间盘退变状况。另外3只细胞培养时取椎间盘用。rAAV2-CTGF-TIMP1按每个细胞10-6个病毒颗粒与适量的无血清HAMF12/DMEM细胞培养液混合,将上述混合液加入PBS缓冲液洗过的二代髓核细胞中以转染细胞。采用上述微创穿刺法,选取L2-3、L3-4、L4-5退变椎间盘,以32G穿刺针穿入髓核内,将22μl的转基因细胞悬液缓缓注射于椎间盘内作为细胞移植组；退变椎间盘内注入磷酸盐缓冲液(PBS)作为退变对照组；正常椎间盘作为空白对照组。分别于6、10、14周行X线观察椎间高度的变化、测定并比较%DHI；行MRI检查以观查椎间盘信号的改变；HE染色、Safranine 0染色及Masson染色观察转基因前后椎间盘组织变化；免疫组化染色观察髓核细胞Ⅱ型胶原的表达；Western-blot鉴定细胞因子CTGF和TIMP1在椎间盘内的表达；35S整合法测定兔髓核组织蛋白多糖合成率；RT-PCR检测Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达。采用统计学软件SPSS15.0进行方差分析和多样本均数两两比较。P<0.05被认为有统计学意义。[结果]CT引导下经皮微创穿刺法具有创伤小、操作安全等优点,MRI证实穿刺2周后椎间盘开始退变,该方法为建立兔椎盘退变模型新的有效方法。腺相关病毒(AAV)可高效转染兔髓核细胞并快速介导目的基因的表达。X线检查示6,10,14周后退变对照组%DHI明显低于细胞移植组,具有统计学意义(P<0.05),提示细胞移植组椎间高度较对照组得以维持。MRI证实,随着观察时间的延长,退变对照组椎间盘退变呈进行性加重。在6、10周、14周,依据改良Thompson法分级,转基因细胞移植组和退变对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。HE染色示转基因细胞移植后髓核内细胞较多,分部较均匀；Safranine 0染色证实转基因后髓核细胞蛋白多糖表达明显增多;Masson染色观察发现转基因细胞移植后,椎间盘的退变延缓明显。Ⅱ型胶原免疫组化染色结果示转基因后兔髓核细胞合成分泌Ⅱ型胶原能力较前有所增加,细胞移植组和退变对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。转基因细胞移植后Western-Blot检测6周、10周及14周时细胞因子在椎间盘内的表达结果显示：CTGF均有阳性表达,而TIMP1在6周及10周时有阳性表达,在14周时表达则明显减弱,提示CTGF在体内椎间盘的表达更具有持久性。转基因细胞移植后第6周,10周及14周,应用RT-PCR检测检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原MRNA的表达,细胞移植组和退变对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05),空白对照组和和退变对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05),细胞移植组和空白对照组相比,差别无统计学意义(P>0.05)。转基因细胞移植后第6周,10周及14周,应用5S整合法检测检测蛋白多糖的合成率,细胞移植组和空白对照组分别与退变对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05),细胞移植组和空白对照组相比,差别无统计学意义(P>0.05)。[结论]微创经皮CT引导下穿刺椎间盘可成功建立兔椎间盘退变模型。腺相关病毒介导的CTGF和TIMP1可以在兔髓核细胞内成功表达。体外转双基因CTGF和TIMP1髓核细胞再行体内移植后,可有助于椎间高度的维持,促进椎间盘正常MRI信号的恢复。免疫组化、RT-PCR及5S整合法均证实转双基因细胞移植可明显促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成,提示可以延缓或逆转椎间盘退变。本研究为探讨基因治疗结合细胞治疗逆转椎间盘退变的方法提供了一个新的途径。