泛素-蛋白酶体途径是调控细胞内蛋白质代谢的一个重要途径,它在很多细胞活动,包括细胞周期、信号传导、DNA修复、受体功能、发育分化、炎症反应中起调节作用。该途径是一个受多种因素调控的可逆过程,这其中存在一些特异性的去泛素化蛋白酶的参与。去泛素化酶通过调节蛋白质的泛素化降解过程而与体内许多生理及病理过程有关,受到众多学者关注。卵巢肿瘤相关蛋白酶(OTUs)是新近发现的一个去泛素化酶家族。它包括从酵母到哺乳动物高度保守的OTU结构域,含有约130氨基酸,具有活性半胱氨酸蛋白酶位点。其中OTU1是在体外首先被证实的具有去泛素化酶活性的OTU蛋白。近年来研究表明,OTU1在细胞内具有多功能特性,除了参与蛋白质泛素化的调节外,还在调控细胞分化及细胞增生方面发挥重要作用。OTU1基因定位于11q13.1染色体上,广泛表达于人类多种组织内。已有用RT-PCR和Western Blot的方法证明OTU1在肾脏组织内表达的报道,但是其具体表达的细胞定位及作用尚不清楚,与肾脏疾病的发生是否有关也无相关报道。饰胶蛋白聚糖(DCN)是一种小分子量的富含亮氨酸的蛋白聚糖,由核心蛋白和一条糖胺聚糖链构成,前者分子量约40 kD,由10～12个富含亮氨酸重复序列的模体构成,目前研究发现DCN有多种功能。本课题组前期实验在肾小球疾病的病理研究中也证实,DCN可以影响肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)的TGF-β1的作用活性,在减少肾炎病变中肾小球ECM沉积、抑制MC增生及肾小球纤维化硬化发展中起重要作用,是肾炎病变中一个重要的拮抗肾炎损伤的因子。近年来,对DCN代谢及调节研究也不断深入。实验表明,DCN的代谢有两种方式。分泌到细胞外基质中的DCN,可被纤维母细胞通过内吞作用内化后,经溶酶体降解。而细胞内的DCN在外界因素作用下,可能通过内质网应激(ER Stress),经泛素-蛋白酶体系统调节降解。本课题组前期实验通过免疫共沉淀等方法,已证实MC内DCN是通过泛素化蛋白酶体途径降解的。同时,在DCN代谢的研究中,我们从DCN免疫共沉淀蛋白的质谱中又发现肾MC中去泛素化酶OTU1的表达,提示MC中OTU1可能与DCN结合,但目前还没有这方面的研究报道。因此,进一步研究MC中OTU1是否影响DCN泛素化降解,对深入研究肾炎病变的机制是有重要意义的。本文我们应用基因重组OTU1质粒稳定转染大鼠MC,成功获得OTU1高表达克隆株。并进一步应用RT-PCR及蛋白分析等实验技术证实了MC中存在OTUl的表达,在炎症因子刺激下OTU1表达升高。同时,免疫组化染色也证实在以MC增生为主的人肾炎组织中,肾小球系膜区OTU1的表达明显升高,提示OTU1表达与肾炎病理改变程度密切相关。在OTU1质粒稳转MC中,OTU1高表达可促进MC中DCN的表达。免疫共沉淀显示OTU1与DCN结合,并影响DCN的泛素化过程,提示OTU1是DCN泛素化过程的调节剂,以上结果表明MC中OTU1对DCN的表达影响可能在肾炎发病机制中发挥作用。同时,由于我们研究的早期还没有商品化的抗体,我们又尝试应用原核诱导表达质粒合成纯化OTU1蛋白,并以微量淋巴结免疫法免疫新西兰兔,制备了OTU1多克隆抗体。第一部分OTU1真核表达质粒的构建及OTU1稳转MC克隆株的建立目的构建OTU1真核表达质粒,筛选出稳定高表达OTU1的大鼠MC克隆株,为进一步研究作准备。方法用PCR法扩增OTU1基因片段,并连接到真核表达载体pIRES2-EGFP上;将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α；经酶切测序鉴定；经脂质体稳定转染到大鼠MC中,通过G418及绿色荧光蛋白筛选出OTU1高表达的细胞克隆,并用RT-PCR和Western Blot进行鉴定。结果PCR扩增出了850bp的OTU1目的基因片段,将其克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上并转化到大肠杆菌DH5α内,经酶切电泳及基因测序正确,构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-OTU1-myc。用脂质体转染后经G418筛选,荧光显微镜下挑出了带有绿色荧光蛋白的克隆,Western Blot结果显示转染MC中可见明显的Myc标签蛋白的表达及OTU1蛋白表达水平升高,且OTU1mRNA水平明显增高,获得了稳定高表达OTU1的MC克隆。结论成功构建了OTU1真核表达质粒,并获得了OTU1高表达的MC稳转克隆株。第二部分OTUl在肾炎系膜细胞中的表达及其与DCN的关系目的探讨OTU1在MC的表达及其与肾炎病理改变的关系,并研究MC中OTU1对与DCN表达的影响。方法培养大鼠和人MC；采用Western Blot和免疫荧光的方法检测细胞中OTU1的基因转录和蛋白表达；采用Realtime PCR和Western Blot的方法观察炎症因子IL-1β和ATS刺激大鼠MC后,OTU1和DCN的mRNA和蛋白水平变化,并应用免疫组化对部分人肾炎活检组织检测了肾小球OTU1的表达分布；用Western Blot方法观察转染前后DCN蛋白变化;采用免疫沉淀的方法检测了MC内OTU1是否与DCN结合及转染前后MC内DCN的泛素化水平变化。结果在大鼠和人的MC中都有OTU1的nRNA和蛋白的表达,两者表达的现象一致；IL-1β和ATS刺激大鼠MC 3h、6h和12h后,OTU1和DCN的mRNA和蛋白水平升高；在人肾炎组织中,OTU1在以系膜增生性肾炎类型中表达明显升高；OTU1基因转染MC后,其过表达上调了大鼠系膜细胞中DCN的蛋白水平;免疫共沉淀证明OTU1可以和DCN相互结合；与未转染组相比,转染OTU1的大鼠系膜细胞中,DCN的泛素化降解减少。小结OTU1可在人与大鼠肾小球MC中表达且表达程度一致,表明动物与人的OTU1同源性非常相似；炎症因子可刺激MC OTU1和DCN表达升高；人肾炎组织的肾小球系膜区OTU1表达升高,表明其表达与肾小球肾炎的病理改变有一定的相关性；基因稳定转染大鼠MC后OTU1过表达可引起MC中DCN蛋白水平升高,免疫共沉淀证明OTU1与DCN相互结合,并引起DCN泛索化降解减少,结果提示OTU1可能是MC中DCN代谢降解的调节因子,并可能与肾炎的发生机制相关。第三部分OTU1多克隆抗体的制备目的制备抗OTU1多克隆抗体,初步探讨其在肾小球组织内的表达方法采用PCR方法扩增OTU1基因片段；将其连接到原核表达载体pProExHTa上；将重组表达质粒转化到大肠杆菌Rosette;酶切测序鉴定；利用诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达；用针对His标签的Ni2+-NTA亲和纯化柱进行OTU1蛋白纯化；经SDS-PAGE电泳和Western Blot分析验证；将纯化的蛋白采用微量淋巴结注射方法免疫新西兰兔；用琼脂双扩散和间接ELISA方法测兔血清效价；采用Western Blot检测其特异性；用自制的抗血清免疫组织化学方法检测OTU1在肾组织的表达情况。结果PCR扩增了850bp的OTU1基因片段,将其克隆到原核表达载体pProExHTa并转化到大肠杆菌Rosette内,经酶切电泳及基因测序正确,构建了原核表达载体pProExHTa-OTU1,经IPTG诱导和Ni2+-NTA纯化后,用SDS-PAGE和Western Blot证实获得了36KD的OTU1融合蛋白,将其免疫新西兰兔后,获得了高效价1：16000的兔抗血清,Western Blot证明OTUl抗血清是特异的,免疫组化结果证实用自制抗血清能在肾脏组织检测到OTU1蛋白的表达。小结利用基因重组技术,成功地构建了原核表达载体pProExHTa-OTU1;成功诱导纯化了OTU1的融合蛋白,并免疫新西兰兔,制备了多克隆抗体；用此抗血清作为一抗来进行免疫组化实验,发现OTU1能在肾小球系膜区内表达。