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一、研究目的高血压肾损伤机制复杂,现有治疗方案疗效有限,需要寻找新的治疗靶点及治疗方案。表观遗传学是高血压肾损伤的潜在病机,而潜阳育阴颗粒早期的临床及实验研究已证实有高血压肾损伤的保护作用。本课题研究目的是结合体内、体外模型,证实潜阳育阴颗粒可以通过表观遗传通路干预高血压肾损伤。二.研究方法1.体内基础实验--潜阳育阴颗粒通过NNMT介导的表观遗传通路改善SHR大鼠肾功能体外实验SHR大鼠分组为正常组、模型组、潜阳育阴颗粒低剂量组(2.1 g/kg/d)、高剂量组(8.4 g/kg/d)、缬沙坦组,血管紧张素Ⅱ造模2周,潜阳育阴颗粒治疗8周后,观察各组血、尿肌酐、尿微量白蛋白等肾功能指标的改变。应用Western-blot检测目的蛋白NNMT、H3K4甲基化、皮层蛋白乙酰化的表达。应用液质联用方法检测NNMT的活性指标MNA。2.体外基础实验(1)潜阳育阴颗粒抑制HEK293T细胞增殖。细胞实验分为正常组、模型组、潜阳育阴颗粒组及缬沙坦组。应用MTT方法观察不同时间(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)、不同浓度(10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,1 0-9 mmol/mL)血管紧张素Ⅱ对293T细胞的增殖作用,选取高血压肾损伤细胞模型浓度。然后,采用安全浓度潜阳育阴颗粒,包括低剂量浓度0.5 mg/mL以及高剂量浓度10 mg/mL,观察对血管紧张素Ⅱ诱导的293T细胞增殖的作用。应用Edu荧光染色法验证潜阳育阴颗粒对血管紧张素Ⅱ诱导的293T细胞增殖的作用,其中Hoechst33342染色的细胞核为蓝色,Edu染色的分裂细胞为绿色,比较各组间Edu/Hoechst比例大小。应用细胞周期流式法,检测各组DNA含量,观察潜阳育阴颗粒对细胞周期的阻滞作用。(2)潜阳育阴颗粒对表观遗传因素的影响。Western-blot检测各组H3K4甲基化水平以及皮层蛋白乙酰化水平。分别采用DNAELISA方法及全基因组甲基化捕获测序方法比较各组整体DNA甲基化水平。(3)慢病毒转染试验验证NNMT与表观遗传因素的关系。慢病毒转染上调NNMT基因表达,在过表达基础上使用NNMT抑制剂MNA(2.5 mM),观察对H3K4甲基化、皮层蛋白乙酰化、SIRT1、SAH的影响。(4)潜阳育阴颗粒对NNMT相关酶的作用。NNMT与表观遗传因素作用得到证实后,观察潜阳育阴颗粒对NNMT相关酶的蛋白、mRNA水平的影响。三.研究结果1.体内基础实验。潜阳育阴颗粒可改善SHR大鼠肾功能,降低血肌酐及尿微量白蛋白,促进尿肌酐的排泄。Western-blot结果示潜阳育阴颗粒可以降低NNMT、皮层蛋白乙酰化的表达,升高H3K4三甲基化的水平。液质联用提示潜阳育阴颗粒可以降低MNA浓度。2.体外基础实验。(1)MTT结果提示AngⅡ 10-7 mmol/mL作用293T细胞48小时,可以有效(P<0.05)促进细胞增殖,为高血压肾损伤细胞模型最佳浓度。结果还发现0.5 mg/mL、10 mg/mL潜阳育阴颗粒可以抑制Ang Ⅱ诱导的细胞增殖。Edu实验再次证实潜阳育阴颗粒低(0.5 mg/mL)、高(10 mg/mL)剂量组可以抑制模型组细胞的增殖,低、高剂量组Edu/Hoechst比例下降至42%和39%。细胞周期流式法表明潜阳育阴颗粒可以将模型组细胞增殖阻滞在G2/M期。(2)Western-blot结果示AngⅡ组H3K4三甲基化水平降低、皮层蛋白乙酰化水平升高,潜阳育阴颗粒可以升高H3K4三甲基化水平,对H3K4单甲基化、二甲基化水平无影响,降低皮层蛋白乙酰化。DNA ELISA检测方法提示模型组DNA甲基化水平高于正常对照组,潜阳育阴颗粒可以有效降低DNA甲基化水平。全基因组捕获测序检测到正常组、模型组及潜阳育阴颗粒组平均甲基化水平有差异,并分析了具体差异化基因、区域及染色体,以及可能相关的通路。(3)Western-blot显示慢病毒转染上调NNMT表达后,H3K4三甲基化、SIRT1表达下调,SAH及皮层蛋白乙酰化的表达上调。使用MNA后,H3K4三甲基化、SIRT1表达上调,SAH及皮层蛋白乙酰化表达下调。(4)潜阳育阴颗粒可以降低NNMT、SAH蛋白及mRNA表达水平,升高SIRT1蛋白及mRNA表达水平,升高SAM mRNA表达水平。四.研究结论体内、体外实验均证明潜阳育阴颗粒可以通过NNMT介导的表观遗传通路改善高血压肾损伤。