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种子大小是作物产量的主要构成因素之一,目前关于种子大小的研究已经取得了较大的进展。在模式植物拟南芥和水稻等植物的研究中,多种途径参与种子大小的调控。生长素信号通路响应因子ARF2（Auxin response factor 2）参与多种植物生理过程,同时也在种子大小的调节中发挥着重要的作用。目前,关于ARF2调控种子大小的研究已经在拟南芥中有相关的报道。本实验室利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创建了甘蓝型油菜突变体bnaarf2,其四突变体材料籽粒大小显著增大,其中,L35种子大小增加了22%,L37种子大小增加了27%。同时利用酵母双杂交等实验发现并证明了BnaARF2可能通过与Bna MPK3蛋白激酶互作来调控甘蓝型油菜种子大小。结果如下:甘蓝型油菜中BnaARF2有四个同源拷贝,分别是Bna A06.ARF2、Bna A09ARF2、Bna C03.ARF2、Bna C09.ARF2。这四个同源拷贝间具有很高的同源性,其中Bna A06.ARF2与Bna C03.ARF2间序列相似性最高,达到了97%;Bna C03.ARF2与Bna A09ARF2间序列相似性最低为85%。BnaARF2蛋白具有三个保守结构域,分别是位于N端的B3结构域,位于中间部分的Auxin＿resp结构域,以及位于C端的AUX＿IAA结构域。甘蓝型油菜各组织以及种子发育各阶段的RNA-seq数据和q RT-PCR结果表明:BnaARF2在甘蓝型油菜的各个组织中都有表达,但是部分拷贝在特定的组织中表达量较高,其中Bna C03.ARF2在子叶中表达量较高,Bna C09.ARF2在花和种子中表达量较高,Bna A09.ARF2在子叶中表达量较高,Bna A06.ARF2在茎杆中表达量较高。BnaARF2的表达量随着种子的发育过程逐渐降低。利用基因编辑技术获得BnaARF2的突变体,对T1和T2代转基因材料表型考察,结果表明bnaarf2四突变体L35、L37的器官大小显著增大,三突变体L38和双突变体L39的器官大小与野生型无显著差异;其他重要农艺性状如每角果粒数、含油量与野生型材料相比无显著差异。角果的长度和宽度的测量得知bnaarf2四突变体材料的角果宽度显著增大,其中L35和L37的角果宽度都比野生型要大37%左右。通过观察L35和L37的真叶叶肉细胞大小,得出四突变体材料的叶肉细胞要显著大于野生型材料。Bna C03.ARF2过表达转基因株系的种子大小和器官大小显著减小,其中L4的种子面积比野生型材料小28%左右,L5的种子面积比野生型材料小15%左右。同时,L4和L5的叶肉细胞大小也显著减小。说明Bna C03.ARF2负调甘蓝型油菜种子大小。酵母双杂交、荧光素酶互补和Pull Down实验结果验证了Bna MPK3与BnaARF2的互作关系。使用CRISPR/Cas9技术构建bnampk3突变体,并鉴定出两个纯合株系L4和L5。这两个株系的种子大小都显著小于野生型株系,其中L4的千粒重减小了27%,L5的千粒重减小了29%。此外,L4转基因后代的幼苗鲜重比野生型降低了60%,L5转基因后代的幼苗鲜重与野生型相比降低了63%。初步说明Bna MPK3可能参与甘蓝型油菜种子大小和生物量的调控。