盐穗木根际产ACC脱氨酶耐盐碱促生菌的筛选及定殖情况的初探

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本研究从新疆五家渠103团盐碱地盐穗木根际土壤中筛选产ACC脱氨酶的细菌,并测定其ACC脱氨酶活性和耐盐碱能力,选择ACC脱氨酶活性和耐盐碱性能优秀的菌株,通过菌落形态学观察、生理生化实验、Biolog鉴定,16S r DNA测序分析对菌株进行鉴定。测试了菌株的固氮、产IAA、溶磷和产铁载体的能力,并制成单菌株菌液和混合菌液处理了玉米和甜瓜种子,评估菌液处理对玉米和甜瓜在盐碱胁迫下的促生效果。构建了带有四环素抗性和绿色荧光蛋白基因的质粒,并成功转入供试菌株中,使之带有四环素抗性和绿色荧光双重标记,从而进一步探究标记菌株在玉米和甜瓜根际的定殖情况。本研究结果如下:(1)通过定向筛选的培养基,经多次分离纯化后,从三份土样中共筛出10株菌落形态不同的具有ACC脱氨酶活性的菌株;筛选出W5、W8、W9这三株菌株ACC脱氨酶活性高,且耐盐碱性能优秀的菌株;经鉴定,将三株菌株分别命名为乳酪短杆菌W5(Brevibacterium casei W5),乳酪短杆菌W8(Brevibacterium casei W8),普沙根瘤菌W9(Rhizobium pusense W9)。(2)W5,W8,W9三株菌均有固氮能力,菌株W9还具有产IAA的能力;通过种子促生实验发现,碱胁迫对玉米和甜瓜的发芽率没有显著影响,但是对芽长、主根长和根数三项指标均有一定的影响,接种菌液能促进玉米和甜瓜在p H7~11的范围内的碱胁迫下的生长,且混合菌剂的效果要比单一菌剂效果好。盐胁迫对玉米和甜瓜的发芽率、芽长、主根长、根数均有显著的影响。随着盐浓度的上升,玉米和甜瓜的发芽率、芽长、主根长、根数均有明显的下降。在0%~2%的盐(Na Cl)浓度范围内,接种菌液能促进玉米和甜瓜在盐胁迫下的生长,且混合菌剂效果比单一菌剂效果好。W5和W9两株菌对玉米和甜瓜在盐碱胁迫下的促生能力没有明显的区别。(3)经菌株耐药性实验发现,菌株W5可耐100μg/m L的氨苄青霉素,25μg/m L的链霉素和10μg/m L的四环素,W9可以耐100μg/m L的氨苄青霉素和50μg/Ml的链霉素,对四环素非常敏感;成功构建了带有绿色荧光蛋白基因和四环素、氨苄青霉素抗性的GFP-p BR322质粒,通过热激法成功将所构建的质粒转入大肠杆菌DH5α感受态,通过Spizizen法成功将质粒转入W5中,通过反复冻融法成功将质粒转入W9菌株中,且所导入的质粒在三株菌中均能稳定遗传。接种菌液能有效促进玉米在盐碱土中的生长,且混合菌株的促生效果比单一菌株好。甜瓜无论是否接种菌液均无法在盐碱土中生长。并得到了菌株在玉米和甜瓜根际土壤中的定殖情况。
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