论文部分内容阅读
目的金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是一种重要致病菌，属葡萄球菌属，它广泛存在于自然界，可以引起多种感染，如皮肤感染、术后伤口感染、肺炎和败血症等。20世纪40年代青霉素问世以后，SA引起的感染得到了很好的控制，但是应用不久，某些菌株对青霉素产生耐药，随着青霉素的广泛应用，SA对青霉素的耐药情况越来越严重。1959年，人类又研制出耐青霉素酶的药物甲氧西林，应用临床后曾有效控制SA产青霉素酶菌株的感染。但是，1961英国首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，此后，MRSA感染几乎遍及全球。目前，治疗MRSA最有效的药物是万古霉素，然而，1997年以来，世界各地发现了耐万古霉素MRSA临床菌株，因此，寻找一种新的有效控制MRSA感染的策略破在眉睫。为了有效对抗MRSA感染，必须寻找新的突破口。反义抗菌策略根据细菌体内基因组学相关信息，以细菌体内增殖、致病性、耐药相关基因为靶点，从阻断相关基因的表达入手，进而达到抑制或杀灭细菌的作用。一些研究已经证实反义抗菌剂在抑制细菌靶基因方面显示出很好的抗菌作用。由于反义抗菌剂的分子量较大，细胞摄入率低，本课题确定以下2个研究目标：（1）寻找抑制MRSA的有效靶基因；（2）研究促进反义分子进入细菌的递药策略。基于上述目标，我们以序列高度保守的金黄色葡萄球菌RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD为靶点，设计并合成抗rpoD的肽核酸，将其与穿膜肽（CPP）共价连接制备成反义抗rpoD肽核酸（anti-rpoD PPNA），体外实验对其抗菌活性进行评价，证实anti-rpoD PPNA抗MRSA的有效性。方法1. anti-rpoD PNA的初步设计和合成在GENBANK中检索金黄色葡萄球菌rpoD基因的序列，应用BLAST软件将检索得到的rpoD基因在SA菌属间（包括耐药菌属）进行同源性分析。依据RNA structure4.6软件预测rpoD mRNA的二级结构，应用Oligowalk5.0和PNATm软件分析靶区域RNA与互补反义寡核苷酸结合的各项参数，综合多项参数确定抗rpoD的反义肽核酸序列，之后采用Fmoc方法在固相载体上自动合成抗rpoD反义PNA-CPP结合物（anti-rpoD PPNA）以及作为对照的PNA、穿膜肽（CPP）和错配序列PNA-CPP结合物（mismatched anti-rpoD PPNA），采用RP-HPLC对样品进行分离纯化，MALDI-TOF测定纯化后样品的分子量。2. anti-rpoD PPNA有效靶序列的筛选及优化用金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌WHO-2、耐甲氧西林MRSA Mu50及西京医院检验科分离的临床多重耐药MRSA作为受试菌，以最低抑菌浓度（MIC）方法对anti-rpoD PPNA进行筛选，对抑菌效果最好的一条序列进行优化，包括改变CPP与PNA连接方向、在PNA与CPP间加入甘氨酸和减少核苷酸数量，然后再进行筛选。3．anti-rpoD PPNA抗MRSA体外活性研究我们用Mu50作为受试菌，采用测定细菌生长曲线、剂量依赖性杀菌效果，对筛选出的anti-rpoD PPNA进行体外抗菌活性评价；用RT-PCR及Western blot法检测最优anti-rpoD PPNA对Mu50rpoD基因的mRNA和蛋白质表达水平的影响，确定其反义抗菌作用的靶位特异性，揭示抗菌作用机制。4. anti-rpoD PPNA对Mu50感染人胃粘膜上皮细胞的保护作用将胃粘膜上皮细胞与Mu50菌株共孵育，建立细胞感染模型，加入不同剂量组anti-rpoD PPNA并设置错配序列对照组、CPP对照组及空白对照组，每2h测定细胞培养液中细菌数量，24h后在光学显微镜下观察细菌形态变化，研究其对感染细胞的保护作用。结果1. anti-rpoD PPNA的初步设计与合成同源性分析结果显示，SA菌属间rpoD基因同源性很高，说明rpoD基因高度保守，是反义抗菌的理想靶点。RNA structure4.6软件预测SA的rpoD基因mRNA的二级结构，选择膨胀环等不稳定部位作为可能的反义作用靶区域，计算其键能，同时，应用Oligo walk5.0和PNATm软件分析靶区域RNA与互补反义寡核苷酸结合的各项参数，挑选出综合参数评估较高的5条PNA序列。采用Fmoc方法合成反义PNA-CPP结合物以及作为对照的PNA、CPP和错配序列PNA-CPP结合物。2. anti-rpoD PPNA有效靶序列的筛选及优化采用最低抑菌浓度（MIC）方法对5条anti-rpoD PPNA进行筛选，得到序列起始位点在233的anti-rpoD PPNA抑菌效果最好，对ATCC29213、Mu50、WHO-2及xijing MRSA的MIC值最小，为了增强它的抑菌效果，我们对其进行优化，主要包括将CPP与PNA氮端相连接、在CPP与PNA间加入甘氨酸及减少核苷酸数量，然后MIC法对其抑菌效果进行测定，最终筛选出anti-rpoD PPNA2332为最优反义序列，它对四种菌株的MIC值均为12.5μM。3. anti-rpoD PPNA抗MRSA体外活性研究生长曲线实验和剂量依赖性杀菌效果实验结果显示，anti-rpoDPPNA2332具有很好的抗菌活性，与生长对照组相比，MIC（12.5μM）或高于MIC剂量的anti-rpoD PPNA2332可实现对Mu50的全程生长抑制，在剂量为40μM时，anti-rpoD PPNA2332显示出杀菌效果。RT-PCR及Westernblot结果显示，anti-rpoD PPNA2332作用后，Mu50的rpoD基因在mRNA和蛋白质水平的表达产物均受到了抑制，而且呈现出浓度依赖性。而内参16S rRNA基因的转录不受影响。4. anti-rpoD PPNA对Mu50感染人胃粘膜上皮细胞的保护作用光学显微镜照片显示，无菌对照组中，高浓度的anti-rpoD PPNA2332（10μM），对人胃粘膜上皮细胞生长没有明显影响，说明细胞毒性较小，而它在1μM时即可对导致细胞感染的细菌起到杀灭作用，保护细胞免受细菌感染所致的形态损伤和死亡。结论1.发现了一个新的抗MRSA的靶点，即编码细菌RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD，确定了该基因序列第233至242共10个核酸序列为最优的反义PNA的靶序列。2.成功利用穿膜肽（KFF）3K与PNA共价连接的方式，将有效的反义PNA递送进入细菌内，并且体外实验证明anti-rpoD PPNA2332具有抗MRSA活性，对MRSA感染的真核细胞起到保护作用。