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单倍体(haploid)指只具有配子染色体组的个体。从1921年Bergner在自然界发现曼陀罗单倍体以来,单倍体因其独特的性质在基础研究、作物遗传育种方面发挥着越来越重要的作用。单倍体育种能大大缩短育种年限,节约成本,提高育种效率。然而,自然界中单倍体的发生频率极低,通过人工诱导产生单倍体同样效率低、成本高、周期长,这在很大程度上限制了单倍体的应用。2010年,Ravi和Simon Chan等在对一份拟南芥cenh3突变体的研究中创建了高效的单倍体诱导系,即用普通H3组蛋白的尾部结构域替换CENH3的尾部结构域,并在其N端加上一个GFP蛋白,构建了GFP-tailswap载体,当用转入GFP-tailswap片段的突变体与其他拟南芥杂交时,来自GFP-tailswap植株的染色体在后代中会消失,形成只含有另一亲本配子染色体数的单倍体后代。这种单倍体的诱导效率在拟南芥中高达50%。CENH3在拟南芥和水稻中具有很高的保守性,其结构和功能都十分相似,这就为在水稻中创建类似于拟南芥的单倍体诱导系提供了条件。然而,水稻中缺乏OsCENH3的突变体,而且OsCENM的突变很可能导致植株死亡,所以本实验选用TALEN技术敲除水稻OsCENH3基因,同时模仿拟南芥GFP-tailswap载体,在敲除的同时转入OsCENH3-tailswap互补载体,探讨水稻中利用着丝粒介导产生高效单倍体诱导系的可能性。实验中得到的主要结果如下：1、通过比对发现,着丝粒特异性组蛋白H3 (CENH3)在水稻和拟南芥中十分保守,两者氨基酸序列相似性达到49.44%。不同物种中CENH3也十分保守,保守区域主要是在蛋白折叠区域HFD,而尾部(tail)结构域变化较大。在水稻中,OsCENH3与H3在蛋白折叠区域也十分保守,但OsCENH3的尾部结构域要比普通H3组蛋白尾部长约30个氨基酸。2、芯片数据分析表明,水稻着丝粒特异性组蛋白OsCENH3编码基因LOC-Os05g41080主要集中在顶端分生组织以及幼穗中表达。3、通过软件分析,为了保证TALEN敲除的特异性,我们在水稻OsCENH3基因的第一个外显子上设计了一个TALEN靶点位置。通过"Golden-gate"方法,成功组装了TALEN质粒模块。并且通过Luciferase SSA活性检测,表明TALEN质粒具有较强基因编辑活性。4、通过in-fusion片段连接技术,成功构建了含有ACTIN-GFP-tai1(H3)-HFD(CENH3)-NOS的互补片段(OSCENH3-tailswap)。通过酶切将此片段连接到含有TALEN序列的最终植物表达载体PCAMBIA1300上。5、使用农杆菌侵染水稻愈伤组织进行转化,共获得了转基因阳性植株249株,其中日本晴(Nipponbare)121株,Kittake128株。6、运用RT-qPCR技术,检测阳性植株叶片中GFP表达量。在随机选取的8株中,有一半植株叶片中GFP蛋白高表达。7、在转基因后代中,使用PCR扩增含有TALEN靶位点的DNA片段,长度为300bp,进行测序,分析突变情况。