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背景目前全球新发癌症发病率和死亡率最高的均是肺癌。仅仅有一少部分患者有手术的机会,大多数不能手术治疗的患者需接受以化疗为主的抗肿瘤药物的治疗。目前第三代表皮生长因子受体络氨酸酶受体抑制剂(EGFR-TKI)奥西替尼因疗效显著已被纳入临床一线治疗行列,尽管应用奥西替尼治疗非小细胞肺癌逆转了第一代吉非替尼和厄洛替尼在临床上的耐药性,但是用药一年后普遍出现了新的获得性耐药。目前有研究证实自噬可以影响靶向药物对肿瘤细胞的作用,经研究发现除了基因出现突变引起的EGFR-TKI耐药以外,自噬也可以引起EGFR-TKI的耐药并影响其治疗。泮托拉唑是临床上常用的一种质子泵抑制剂(PPI),目前已经被证明可以抑制自噬。所以我们对泮托拉唑是否可以通过抑制自噬影响奥西替尼在肺癌治疗过程的作用及机制进行了研究。目的1.在非小细胞细胞系中检测泮托拉唑联合奥西替尼对肺癌细胞系自噬及生长抑制的影响,分析自噬水平与药物作用的关系;2.构建人源肺癌异种移植模型,筛选可用的、有代表性的人源肺癌异种移植模型用于体内实验;3.采用人源肺癌异种移植模型评价联合应用泮托拉唑和奥西替尼的在活体内的可行性、有效性、安全性及抗肿瘤作用的机制。方法1.以四种不同的EGFR野生型和基因突变型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系为研究对象。应用CCK8检测药物对细胞系活性的影响;筛选两株细胞株做功能实验,用流式细胞检测技术检测药物对细胞ROS及凋亡率的影响;应用Western Blot对自噬相关蛋白p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ATG5的表达进行量化以及检测相关通路蛋白PI3K/Akt/mTOR的表达;用mRFP-GFP-LC3转染细胞后进行荧光显微镜检查,评价OSI±PPI对自噬流的影响;通过转染siRNA ATG5抑制自噬通路中的关键蛋白后,再次应用以上方法检测药物对细胞活性及自噬的影响。2.构建人源肺癌异种移植模型,针对性的筛选2株PDX模型,通过常规病理、免疫组化、基因测序检测模型的可用性;3.在人源肺癌异种移植模型中单用或者联合应用泮托拉唑和奥西替尼,观察瘤体的变化记录生长曲线,应用免疫组化检测瘤体自噬相关蛋白P62、凋亡蛋白caspase-3以及相关通路蛋白PI3K/Akt/mTOR的表达,应用TUNEL实验检测动物模型中肿瘤的凋亡水平。结果1.单独应用泮托拉唑对A549,NCI-H1975,HCC827,和PC9肺癌细胞系均有轻度的抑制作用但与对照组相比没有统计学差异;单独应用奥西替尼对以上四种肺癌细胞系均有明显抑制,且相比对照组有统计学差异(P<0.01),但在野生型A549细胞系中奥西替尼的抑制效果略低于其他三组(p<0.05);而泮托拉唑和奥西替尼两药联用对四种肺癌系均有明显的抑制作用,且与单用泮托拉唑组或单用奥西替尼组相比较均有统计学差异(P<0.01)。2.肺癌细胞抑制机制研究中,药物处理A549,NCI-H197肺癌细胞系,泮托拉唑和奥西替尼两药联用的细胞内产生的ROS最高,凋亡率最高。转染ATG5-SiRNA后,药物处理A549,NCI-H197肺癌细胞系,两药联用导致的凋亡率最高,较两药联用的未转染组更高,同时两药联用导致的ROS最高,较两药联用的未转染组更高。转染ATG5-SiRNA+奥西替尼与泮托拉唑+奥西替尼引起的凋亡率、ROS升高趋势类似。3.自噬检测结果:单独用奥西替尼处理A549,NCI-H1975肺癌细株后细胞内LC3-Ⅱ较对照组表达升高,而P62较对照组表达降低;单独用泮托拉唑处理肺癌细株可以看到细胞内LC3-Ⅱ较对照组表达降低,而P62较对照组表达升高;两药联合应用后观察到细胞内LC3-Ⅱ的表达低于对照组、奥西替尼组LC3-Ⅱ的表达,而P62较对照组、奥西替尼组表达升高,有统计学差异(P<0.05)。荧光标记LC3后药物处理肺癌系A549,NCI-H197,奥西替尼组的红色荧光较对照组增加,而黄色荧光较对照组减少。单用泮托拉唑或者两药联用可以观察到代表自噬体和溶酶体结合的红色荧光较对照组减少,而代表普通自噬体的黄色荧光较对照组增多,其差异有统计学差异(P<0.05)。转染ATG5-SiRNA的两株细胞内的LC3-Ⅱ较对照组表达减低,而P62较对照组表达升高。单独用奥西替尼处理转染肺癌细株可以看到细胞内LC3-Ⅱ较对照组表达轻度升高,而P62较对照组表达轻度降低;单独用泮托拉唑处理转染后肺癌细株可以看到细胞内LC3-Ⅱ较对照组表达轻度降低,而P62较对照组表达轻度升高;两药联合应用可以观察到细胞内LC3-Ⅱ的表达低于对照组、奥西替尼组LC3-Ⅱ的表达,而P62较对照组、奥西替尼组表达升高,但无统计学差异。转染ATG5-SiRNA的两株细胞内,奥西替尼组的红色荧光较对照组增加,而黄色荧光较对照组减少。单用泮托拉唑或者两药联用可以观察到代表自噬体和溶酶体结合的红色荧光较对照组减少,而代表普通自噬体的黄色荧光较对照组增多,但其差异无统计学差异。4.转染ATG5-SiRNA前后,药物处理对ATG5的影响。在非转染组中,单独用奥西替尼处理肺癌细株可以看到细胞内ATG-5的表达较对照组表达增高,;单独用泮托拉唑处理肺癌细株可以看到细胞内ATG-5较对照组表达降低;两药联合应用可以观察到细胞内ATG-5的表达低于对照组。在转染组中,单独用奥西替尼处理肺癌细株可以看到细胞内ATG-5的表达较对照组区别不大;单独用泮托拉唑处理转染后肺癌细株可以看到细胞内ATG-5较对照组表达降低;两药联合应用可以观察到细胞内ATG-5的表达与对照组无明显区别。5.我们构建EGFR野生型、EGFR突变型PDX模型各1例,对原代和G3代相关诊断指标进行HE、IHC检测,对比发现在两株肿瘤模型中G0与G3的Ki67、HER1、HER2及ALK表达均未见明显差异。我们按照NEJM2016中51个肺癌相关基因的Panel进行基因突变对比,其中36个基因在两例模型中均未检测到突变,G0和G3基因表达一致率在两例模型中分别为Model 1 92.1%(47/51)以及 Model 292.1%(47/51),Mode12 PDX 模型检测出了 EGFR-T790M突变,我们对比了突变频率G0 7.3%、G3 9.7%,没有发现统计学差异。6.在两例PDX模型中,奥西替尼联合泮托拉唑都能明显抑制肿瘤生长,与单用奥西替尼组差异具有统计学意义(P<0.05),单独应用泮托拉唑组相比PBS组肿瘤体积也有抑制,但没有统计学意义。单独应用奥西替尼与单独应用泮托拉唑相比有统计学意义(p<0.05)。在带有EGFR突变的模型2中,奥西替尼联合泮托拉唑的抑制作用更明显,肿瘤平均体积明显低于奥西替尼组、泮托拉唑组,差异具有统计学意义(p<0.01)。7.应用IHC检测不同处理组肿瘤中P62的表达用来评价肿瘤瘤体内的自噬水平,可以看出自噬底物蛋白P62在奥西替尼组的表达明显下降与泮托拉唑组比较有统计学差异(P<0.01),而泮托拉唑组的P62较对照组有所上升,但没有统计学差,两药联用组的P62较奥西替尼组增多,有统计学差异(p<0.05);两药联用组的P62较泮托拉唑组减少,有统计学差异(p<0.01)。8.应用IHC检测不同处理组肿瘤中Ki67和caspase-3的表达;应用TUNEL实验检测瘤体内的凋亡细胞用来评价肿瘤瘤体内的凋亡水平。实验结果在两个PDX模型中,Ki67在奥西替尼联合泮托拉唑组的表达明显下降与单用奥西替尼组、单用泮托拉唑组比较有统计学差异(p<0.01),caspase-3的表达在奥西替尼联合泮托拉唑组的表达明显升高,与单用奥西替尼组、单用泮托拉唑组比较有统计学差异(p<0.01)。两药联用组的肿瘤细胞的凋亡数较奥西替尼组、泮托拉唑组明显增多,有统计学差异(p<0.01)。在Model1中,单独应用奥西替尼组与单独应用泮托拉唑组比较,KI67、caspase-3表达无统计学差异,TUNEL实验中凋亡细胞数有统计学差异(p<0.05);单独应用泮托拉唑相比对照组,在Ki67和caspase-3的表达及凋亡细胞数量有一定影响,但没有统计学差异。在Mode12中,单独应用奥西替尼组与单独应用泮托拉唑组比较,KI67、caspase-3表达有统计学差异(p<0.01),TUNEL实验中凋亡细胞数也有统计学差异(p<0.05)。单独应用泮托拉唑相比对照组对Ki67和caspase-3及凋亡细胞数量有一定作用,但没有统计学差异。9.我们应用IHC检测不同处理组肿瘤中PI3K p-AKT,and p-mTOR的表达。结果显示,Model1中,两药联用影响了 p-AKT、PI3K的表达,与单用奥西替尼相比有统计学差异(p<0.05),两药联用影响了 p-mTOR的表达,但与单用奥西替尼相比无统计学差异;奥西替尼抑制了 PI3K p-AKT,and p-mTOR的表达,与单用泮托拉唑组相比有统计学差异(p<0.01)。Model2中,两药联用影响了p-AKT、PI3K和p-mTOR的表达,与单用奥西替尼相比有统计学差异(p<0.05),与单用泮托拉唑组比较有有统计学差异(P<0.01);奥西替尼抑制了 PI3K、p-AKT,and p-mTOR的表达,与单用泮托拉唑组相比有统计学差异(p<0.01)。10.两例模型各组小鼠体重无明显差异,联合用药组组体重略下降但未达统计学意义。检测肝肾功能多项生化指标提示,奥西替尼联合泮托拉唑对小鼠各脏器功能无明显影响。结论:1.在各肺癌细胞系和人源肺癌异种移植模型中奥西替尼均导致细胞的自噬水平升高,泮托拉唑可以抑制奥西替尼引起的细胞自噬;2.在各肺癌细胞系和人源肺癌异种移植模型中泮托拉唑激活了被奥西替尼抑制的PI3K/Akt/mTOR通路;3.在各肺癌细胞系和人源肺癌异种移植模型中泮托拉唑增强了奥西替尼的抗肿瘤活性,在有EGFR基因突变的肺癌细胞系和人源肺癌异种移植模型中效果更显著;4.在细胞系中通过促进ROS的产生,泮托拉唑增强了奥西替尼诱导的凋亡;5.在人源肺癌异种移植模型中泮托拉唑增强了奥西替尼诱导的凋亡,在有EGFR基因突变的人源肺癌异种移植模型中凋亡更显著;6.成功筛选了适用模型2株,证明第一代和第三代模型在组织形态、免疫组化标志物和基因分子水平可以很好的维持原代肿瘤的特性。7.奥西替尼和泮托拉唑两药联用可行性、安全性好。