青霉菌灭活菌丝体诱导拟南芥抗性机制研究及AT1G13520基因功能初探

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青霉菌灭活菌丝体(Dry mycelium of Penicillium chrysogenum),DMP为其水提物,作为一种生物防治剂,前期试验发现其可诱导植物抗病,激活植物系统获得抗性。目前青霉菌灭活菌丝体已经广泛利用于水稻,烟草,三七和番茄等农作物的大田病害防治,近5年推广面积达500万亩,病害防控效果优于大部分的生防剂。但是青霉菌灭活菌丝体诱导植物抗性的分子机制和可能的信号通路仍没有全面的报道。为了更好的阐明青霉菌灭活菌丝体诱导的信号通路,本文以拟南芥为研究对象,利用转录组测序检测DMP,茉莉酸(jasmonic acid,JA),水杨酸(salicylic acid,SA)和清水(water)处理拟南芥后植株的m RNA水平。分析DMP和SA,JA处理后差异表达基因。通过数据比对和实时荧光定量探究DMP参与的信号通路途径。同时,根据转录组数据和大数据平台的筛选我们获得了一些缺乏报道的差异表达基因,利用CRISPR/Cas9技术和过表达技术构建拟南芥基因敲除和过表达突变体,通过表型探究基因功能。本论文取得的主要结果如下:(1)转录组文库构建成功构建了DMP,SA,JA,water处理后拟南芥的转录组文库,DMP,SA,JA,water处理分别获得了23,153,931,24,526,880,22,357,353,22,357,353个reads,Q30都在90%以上。4个样品的reads与参考基因组的效率均在96%以上。表明文库质量良好。19746,19742,19802,19577个基因分别在DMP,SA,JA,water处理组中有表达。通过和water处理(CK)比较DMP vs CK,JA vs CK,SA vs CK三个组别分别找到了445,1018和668个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。GO(Gene Ontology)和COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)分析DEGs,三组数据在不同功能分类中富集趋势基本一致。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析结果显示DMP处理后DEGs在四个通路中有显著富集(p<0.05),其中3个与SA处理相同,剩余一个和JA处理相同。通过具体通路基因筛选,找到三个通路节点基因PR1,EIN3和FRK1在DMP处理后有高表达,三个基因分别属于SA,JA,PTI(PAMP-triggered immunity)信号通路。转录组数据分析说明DMP作为诱导剂和SA处理后基因变化相似度高,同时DMP也诱导了拟南芥中信号通路的交互。(2)青霉菌灭活菌丝体诱导拟南芥后通路验证为进一步验证DMP诱导的信号通路,通过q RT-PCR检测DMP处理拟南芥后关键通路基因随时间点的变化规律发现,相比于0 h SA通路中上游调控基因EDS5和NIMIN1在24 h和48 h时都有上调。关键节点基因NPR1,NPR3和NPR4 24 h时表达量到最高。表达量明显上调的是下游应答基因PR1,PR2和PR5,这些基因在24 h时就有明显上调。检测TGA家族发现TGA1,3&7在DMP处理后有高表达。表明DMP处理可以诱导拟南芥中SA通路的激活。JA/ET通路方面,DMP处理诱导了JA和ET通路共有基因EIN2,EIN3,ERF1和PDF1.2的上调,抑制了JA通路ERF1和VSP2基因的表达量。而EIN2调控的下游通路与SA信号通路有相互促进的作用,DMP可以诱导完整的SA信号通路基因并且与JA/ET通路有交互。另外DMP诱导了内源SA的积累,和PTI中FRK1和SID2基因的上调,表明DMP通过PTI诱导了下游SAR(systemic acquired resistance)。通过GC/MS检测排除DMP中小分子化合物的干扰,我们首次证明DMP通过PTI激活了内源SA积累依赖的下游SAR相关信号通路基因和JA信号通路。这为以后DMP有效物质的分离鉴定提供了参考,同时为DMP的应用提供了更充分的分子理论依据。(3)AT1G13520基因的功能预测和验证利用转录组分析和数据比对,从DMP诱导的转录组DEGs中筛选到一个有趣的基因(AT1G13520),文献对其报道较少。通过实验表明AT1G13520对不同诱导和胁迫有响应,在SA诱导前期上调表达;JA处理后明显抑制;DMP,ABA处理拟南芥后该基因也上调表达,表明该基因可能参与信号调控。同时,该基因对冷处理和干旱处理都有不同的响应模式。克隆其目的基因序列,与NCBI数据中有一个碱基有差异。同时体外我们成功表达了AT1G13520的目的基因蛋白,便于后期抗体的制备。对序列进行生物信息学分析,通过结构分析,推测其功能与毒蛋白有关;通过功能注释,推测其与SA通路有关;根据前人酵母双杂结果推测其与能量代谢相关,为以后基因功能鉴定提供了一定的方向。为了研究AT1G13520基因的功能我们利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated systems 9)技术和过表达技术分别构建了AT1G13520基因敲除突变体和过表达突变体。成功构建了能提前终止AT1G13520翻译的敲除突变体,定量检测显示突变体中该基因的m RNA水平显著低于对照。同时成功筛选到过表达突变体,定量检测其可以过表达目的基因。敲除突变体莲座叶直径明显大于野生型,过表达植物也有互补表型。敲除该基因可以明显提前拟南芥的花期。SA处理AT1G13520基因敲除突变体,表明基因缺失后SA通路中的调控和应答基因SID2,WRKY70和PR1相对于野生型表达量明显下调,同时敲除突变体中在SA处理后内源SA无富集。以上结果表明AT1G13520基因可能参与调控植物的生长;另外AT1G13520在SA信号通路的上游起调控作用,可以影响依赖SA富集诱导的下游信号通路,验证了对其功能的预测。
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