昼夜节律几乎影响了生物体生命活动的方方面面,帮助其趋利避害,实现和外界环境的同步和适应,是生命的基本特征之一。雌禽的排卵-产蛋循环便具有明显的节律性和环境适应性,具体表现在排卵(产蛋)时间偏好、连产间歇等方面。时间生物学和生殖内分泌学的发展为解释上述现象提供了理论基础,但性腺轴上的调控复杂交错,卵泡的成熟,排卵和蛋的形成是多组织、多过程、多层次参与的生理事件,其间不同生理进程在时间上的吻合显示了机体自身的协调统一。单独研究神经内分泌或卵泡的发育无法全面的解释排卵-产蛋这一复杂又特殊的生理过程,本研究从昼夜生物钟系统切入,整合各过程的时间控制因素,解析排卵-产蛋中的节律现象。1.产蛋监测与产蛋规律分析本研究通过记录母鸡在特定时间段里的具体产蛋时间,得到了商品蛋鸡罗曼粉壳蛋鸡在常规饲养条件下的产蛋性状,包括：产蛋时间分布、连产间歇、间歇前一天产蛋时间分布和产蛋间隔时间。结果发现：母鸡产蛋有极强的时间偏好性,主要集中在8：00一12：00这个时段：产蛋性能好的母鸡产蛋时间间隔以24小时为轴心左右波动。连产间歇前一天的产蛋时间在早、晚两个时段密集分布,说明接近开放期的前后边缘都会造成产蛋间歇。证实了产蛋开放期模型。通过产蛋规律的监测,挑选出了生理状态一致(产蛋时间和产蛋周期一致)的鸡群作为后续的试验材料。2.时钟基因的节律性表达与发条机制的定位本研究通过检测时钟基因(Bmall,Bmal2,Clock, Per2, Per3,Cryl,Cry2)在等级卵泡的颗粒细胞和膜细胞以及输卵管的四个部位中的表达情况,运用余弦分析法检测其表达是否呈现显著性节律震荡,结合生物钟运行的分子机制,将时钟基因在一个昼夜周期内的表达规律加以组合,根据峰值时间关系确定生物钟发条机制在该组织中是否存在。结果表明：生物钟发条机制在F1-F3卵泡的颗粒细胞以及输卵管的伞部和子宫部中存在,并且确定了在其他检测组织中(如膜细胞)不存在运行的生物钟发条机制。比较颗粒细胞中生物钟节律的强度和时相状态(标志性时钟基因的峰值时间)发现,F1中节律震荡最强,F2次之,F3最小,但它们之间的时相状态没有明显区别。输卵管的子宫部时相状态要显著早于伞部。3.促黄体素对时钟基因表达的调控及机理研究本研究通过添加特异性的信号通路阻断剂,从时钟基因的表达变化来探索促黄体素(Luteinizing hormone, LH)对时钟基因调控的分子机理。体外培养的F1颗粒细胞施加地塞米松同步化处理作为对照组,试验组添加LH处理。结果发现,24小时周期内,对照组和试验组中时钟基因表达趋势都较平缓,余弦分析节律性时均未达到显著水平。施加LH处理4个小时后(Zeitgeber Time 4, ZT4),Bmall的表达量显著增高；Per2在ZT4和ZT8两个时间点试验组均显著的高于对照组；Clock在LH处理后表达不再有任何波动变化；Cryl在ZT12,ZT20,ZT24三个时间点表达量都是试验组显著的高于对照组。添加cAMP抑制剂(H89)可以阻断LH对时钟基因Bmal1和Per2的促进作用,证明了LH对时钟基因的调控依赖于cAMP/PKA信号通路。单独抑制Erkl/2和p38MAPK信号通路对Bmal1的阻断作用不显著,但都显著的阻断了对Per2的促进作用,当同时抑制Erkl/2和p38MAPK时,Bmal1和Per2的表达均接近对照组,显著的低于LH处理组,证明了Erkl/2和p38MAPK两条通路协同作用传导LH带来的胞外信号。4.全面筛选F1卵泡颗粒细胞中的时控基因本研究采用高通量测序技术检测了F1卵泡中颗粒细胞在一个完整昼夜周期内的表达谱,通过"JTK CYCLE"算法筛选时控基因(受生物钟发条机制调控的基因),全景式的描述卵泡颗粒细胞生物钟参与的生理过程和调控通路。结果表明：365个基因具有昼夜节律性表达,调控和参与了众多的生理功能和生物学过程,主要富集在核糖体蛋白和剪切蛋白通路。核糖体蛋白和肿瘤发生有密切的关系,因此母鸡卵泡可作为研究卵巢癌的模型；剪切蛋白负责的剪切作用是一种重要的转录后修饰,表明发条机制不仅通过转录因子来调控下游基因的表达,还可以通过剪切作用影响下游基因的最终丰度。综上,本研究以昼夜生物节律为主线,通过检测时钟基因的节律性表达在母鸡繁殖系统中对生物钟发条机制进行定位,探索了颗粒细胞中影响时钟基因表达的同步化信号通路,并采用转录组测序筛选得到了颗粒细胞中的时控基因,整体上解析了排卵-产蛋过程中的节律现象,为后续繁殖性能的深入研究提供了借鉴与参考。