番木瓜SGT1和RAR1的功能验证及WRKY转录因子的研究

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植物在生命活动周期中会不断的遭受到生物和非生物胁迫,SGT1、RAR1在植物的抗病信号传导过程中的作用非常重要,WRKY转录因子在植物应对各种胁迫方面有着提高抗性的重要作用,从不同的转基因拟南芥株系对SGT1、RAR1的功能进一步进行验证,并对番木瓜WRKY转录因子的表达模式及功能进行研究揭示其抗性机理,为番木瓜抗病性研究筛选出候选的抗性基因提供有力的依据。PGA作为一种有无害无毒、可降解、无残留等特性的物质在农作物上的也开始广泛的应用,目前已发现能促进作物的生长与增强植物抗病及抗逆境能力,而PGA使植物增强了对逆境的适应和抗逆性的机制有待实验证实。本实验对T1代转基因pBI121-RAR1拟南芥R1、R2、R3三种株系与T1代转基因pBI121-SGT1拟南芥S1、S2、S3三种株系之间通过表型、抗性和相关抗性基因的表达来对SGT1、RAR1两个基因的功能进行验证;对番木瓜进行加入外源PGA处理,并且对其进行胁迫诱导,运用实时荧光定量PCR技术检测其中10个WRKY基因的表达水平,其中得到的主要结果是:1.通过从主根长度和花轴长度这两个方面对野生型和转基因株系进行对比分析结果差异明显;在渗透胁迫条件下,转基因拟南芥株系R1、R2、R3中的发芽率明显高于野生型,证明了RAR1在植物生长发育初期起着重要的作用,而在各株系之间抗胁迫的能力又不相同,株系R3在甘露醇条件下的发芽率明显高于R2和R1,株系S2和S3的发芽率也明显高于S1;观察在渗透胁迫条件下对根长变化的影响,结果显示6种转基因株系比野生性对胁迫条件的敏感性程度更高,而转基因VBI121-RAR1株系相对于转基因VBI121-SGT1株系在盐(NaCI)胁迫中的敏感程度也更高,说明了RAR1和SGT1在拟南芥生长发育时期对渗透胁迫的抗性反应起到一定的作用;氧化胁迫实验得到的结果为在氧化胁迫的条件下48h后,叶片出现的褐化干枯最严重的是野生型,在pBI121-SGT1的3种株系pBI121-RAR1的3种株系的叶片也发生了褐化干枯的现象,不过相对于野生型有所延迟;用拟南芥的离体叶片对其接种核盘菌,当侵染时间为20h时,所有转基因株系的发病率明显低于野生型的发病率。当病原菌侵染叶片40h后,野生型的叶片上已经几乎布满了病斑,而在6种转基因株系的叶片上的病斑扩散现象并不是很明显,说明了SGT1和RAR1这两个基因在拟南芥的抗病反应中起着一定的作用;EDS1、NDR1、LOX2、RPP5这4个均是与抗性相关的基因,在pBI121-SGT1的3种株系和pBI121-RAR1的3种株系和野生型(Col-0)拟南芥中经NaCl所诱导的非生物胁迫和生物信号分子SA、 MeJA、ABA所诱导的生物胁迫后,这些与抗性相关基因的表达量在有的转基因株系中高于野生型,说明了抗性相关基因的表达情况受到了SGT1和RAR1基因的超表达的影响。但转基因不同株系中各与抗性相关基因的表达量又不尽相同,这说明可能与植物的激素水平和外源基因拷贝数相关系。2.以施加含有PGA营养液的番木瓜苗(实验组)相对于对照组(未含有PGA营养液)的植株形态学比较,实验组生长的更加健壮,主根也较长。为研究PGA使植物增强了对逆境的适应和抗逆性,对其进行SA、低温、干旱、PRSV病原侵染这4种逆境,处理7d后观察各植株的生长情况,发现实验组的植株的不良生长状况明显好于对照组,上述实验结果在生理外形上对PGA增强植物抗性提供理论依据。3.对实验组和对照组进行SA、低温、干旱、病原菌侵染这4种逆境再对与抗性有关的10个番木瓜WRKY转录因子的表达情况进行检测并分析。实验结果总结出未施加PGA的对照组植株受胁迫诱导后,其中TF12.199、TF12.62、TF18.51、TF21.156这4个转录因子的表达量相对于未进行胁迫诱导的对照组基因的表达量差异显著;施加PGA的实验植株受胁迫诱导后TF5.242、TF72.14、TF807.3这3个转录因子的表达量相对于未进行胁迫诱导的对照组的基因的表达量差异极其显著。这10个番木瓜WRKY转录因子都参与了植物的抗性反应调控中。实验组和对照组中转录因子的表达情况不尽相同,说明PGA也参与植物对抗非生物胁迫和生物胁迫的调控反应中,其机制可能是通过诱导相关抗性基因的上调和下调来增强植株抗性的,有待进一步探究。
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