背景、目的人类乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是正嗜肝脱氧核糖核酸(DNA)病毒属的一个成员,其基因组是一个长约3.2kb的不完全双链环状DNA,其长链上有4个开放阅读框架(open reading frame,ORF),分别称为S、C、P和X,编码外膜蛋白、核壳蛋白、聚合酶和X蛋白。HBV虽然是DNA病毒,但在其复制过程中存在一个从前基因组RNA逆转录到DNA的重要环节,病毒一旦进入宿主体内后,具有双链环状的病毒DNA在人体内进行复制,病毒长期持续的感染,最终导致慢性乙型肝炎的形成,通常情况下,病毒在人体内经历数十年的持续感染,可导致肝硬化的形成,最终超过三分之一的肝硬化患者会直接导致肝癌的生成。慢性HBV感染的抗病毒治疗一直是医学界的重大难题。现临床上被批准的用于治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药物主要有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等核苷酸类似物。在若干年的临床治疗过程中人们发现,这些药物对乙型肝炎e抗原(hepatitis B e Antigen,HBeAg)的有效清除以及HBV DNA的抑制,都起到了一定的效果,但是在临床上对患者长期的治疗过程中,由于药物长期作用,病毒所出现的耐药性突变亦是我们不可忽视的。病毒耐药性突变的出现,导致随后对病毒的治疗效果不佳,这也是临床上对慢性HBV感染的抗病毒治疗所急需解决的问题。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象,这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。这一现象广泛存在于自然界各级生物体当中,是生物体清除病毒等外源性核酸或突变及异常表达内源性基因的一种自我保护机制。在哺乳动物中,短至21—23nt的双链RNA可以作为小干扰RNA分子(small interfering RNAs,siRNA)与Dicer以及其它蛋白因子共同形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC中的siRNA以其反义链与互补的mRNA结合,置换出正义链。双链mRNA被相关酶识别,导致整条mRNA链被降解,进而抑制相应基因的表达。近几年来国内外有多篇文献报道了siRNA对HBV复制抑制作用的研究,相关的研究数据亦表明了siRNA分子对降低HBV的基因组相关被抑制基因的表达起到了较好的效果。但是绝大多数的实验设计都是针对HBV基因组中的核心蛋白(core protein,C)、聚合酶蛋白(polymerase protein,P)和表面蛋白(surface protein,S)而言的。HBV X蛋白(x protein,X)是HBV基因组的重要结构部分,通过以往的研究结果人们推测HBX在肝癌的形成过程中起到了很大的推动作用,作为一个多功能调节蛋白而言,HBx通过与宿主肝细胞中相关因子的相互影响,在对病毒转录、细胞信号传导、周期调控与细胞凋亡的过程中均有不同程度的作用。本研究选用HBx作为作用靶点,采用RNA干扰技术进行抗HBV感染的尝试。首先建立了HBV-adr亚型细胞模型(HepG2.2.15细胞),并将所筛选的三条抗HBV的特异siRNA序列导入HepG2.2.15细胞,通过real-time RT-PCR分析细胞中HBx mRNA在抑制后的表达水平同时运用Western blot检测乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的含量,实验结果证实了我们所设计的siRNA能特异性抑制HBx基因的表达进而影响HBV病毒的复制。RNA干扰技术具有效果好、特异性强的优势,是一种有较强抗病毒应用潜力的新途径。÷整个课题设计分三个部分阐述:一、HBV-adr亚型细胞模型的建立方法和结果1、adr亚型HBV全基因片断的分离纯化;2、HBV双拷贝插入片断制备,克隆入pcDNA3的EcoRV酶切位点;3、筛选头尾相连的重组质粒pHBV2;4、脂质体介导转染HepG2细胞;5、G418筛选稳定表达的细胞株,鉴定。结论成功建立了HBV-adr亚型细胞模型,可用于后续的siRNA抑制实验。二、筛选特异高效抗HBV的siRNA分子方法和结果1、输入HBV的X蛋白mRNA全序列,运用在线软件,找出所有可能有效的siRNA分子序列;2、将上述序列与人基因组进行比对,筛选出抗HBV的特异序列,同时选择一条非特异性序列作为阴性对照;3、序列导入细胞模型(HepG2.2.15),收集不同siRNA的抗HBV效果的基本资料。结论1、成功筛选出三条抗HBV的特异序列2、三条siRNA在脂质体的介导下成功转染HepG2.2.15细胞三、收集不同siRNA的抗HBV效果方法和结果1、实验分组:按照转染入HepG2.2.15细胞siRNA的不同,实验分为五组。空白对照:细胞中不转染任何siRNA;阴性对照:细胞中转染非特异性siRNA;阳性对照1:细胞中转染特异性siRNA1;阳性对照2:细胞中转染特异性siRNA2;阳性对照3:细胞中转染特异性siRNA3;2、HBV复制水平的检测:运用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测各组HepG2.2.15细胞中HBV的mRNA含量;结果显示:各个处理组细胞中HBV的mRNA表达量与空白对照细胞中HBV的mRNA表达量相比,在24h、48h、72h的抑制率分别为:阴性:0.98%±0.13%,—2.86%±0.30%,0.34%±0.08%;siRNA1:40.41%±4.35%,47.82%±3.46%,23.37%±2.46%;siRNA2∶51.25%±3.51%,55.33%±2.39%,41.90%±3.37%;siRNA3∶43.84%±5.32%,45.18%±3.26%,34.42%±3.42%。3、HBV表达产物的检测:western blot检测细胞上清中乙肝表面抗原(HBsAg)。结果显示:转染入三种特异性siRNA序列的细胞上清中HBsAg含量显著降低,而阴性对照细胞中HBsAg含量基本没有变化。结论1、实验所筛选的三条特异的抗HBV的小RNA分子能降低HepG2.2.15细胞中HBV mRNA的表达水平和HBsAg含量2、非特异性阴性对照siRNA不能使细胞中HBV mRNA的表达水平和HBsAg含量降低3、siRNA对HBV基因表达的抑制作用是特异性的