工业化酶制剂的品质改良及新品种的开发是现代生物技术介入最多的一个领域,并已取得令人瞩目的成果。DNA重组技术对酶工业的渗透,促进了酶工业的飞跃发展,使酶制剂产品品种增加,质量提高,成本下降,给社会带来了巨大的经济效益。国际上广泛采用基因工程、蛋白质工程等高新技术,大大提高了菌种产酶能力,增加了酶的稳定性,提高了酶在各种环境中的反应效率。脂肪酶是一种广泛存在的水解酶,能催化酯键水解及其逆向反应,即在非水相体系中催化酯合成和转酯反应。由于其催化功能的多样性和作为一种生物催化剂的优越性,脂肪酶在许多领域具有广泛的应用,是最常见的工业用酶之一。但目前脂肪酶工业应用的瓶颈问题是其成本较高,因此构建产酶活力高的工程菌是当前研究的热点。米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶（RML）工业应用较广泛,具有优良的Sn-1立体特异性和催化活性。本研究运用基因工程技术,以毕赤酵母表达RML目标产品,旨在建立毕赤酵母表达异源脂肪酶高效发酵表达工艺。相应研究分为三部分:1). RML脂肪酶的克隆表达与高产菌株的筛选。合成RML基因,并构建分泌型表达载体,扩增后转化毕赤酵母,筛选高产重组菌;2).酵母表达条件优化。在摇瓶中,通过对碳源、氮源浓度优化无机培养基组成,对pH、温度和诱导剂浓度优化,在摇瓶阶段取得较高的细胞密度和蛋白表达量,为后续的重组酶的性质研究奠定基础;3).对重组RML脂肪酶进行性质研究,包括:最适pH值和pH值稳定性、最适温度和热稳定性、金属离子对酶活的影响和底物特异性等,以此考察重组RML脂肪酶的理论研究和工业应用价值。本研究参考己报道的米黑根毛霉脂肪酶前体序列（P19515,GI:417256）设计了一对特异性引物,在上下游引物两端分别引入了SnaBⅠ和AvrⅡ酶切位点,从质粒pGAP-RML中成功扩增出编码RML的成熟肽基因,经双酶切与载体pPIC9K连接,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML。转化E.coli DH 5α,筛选阳性克隆。重组质粒pPIC9K-RML经SalⅠ内切酶线性化,用LiCl法转化整合到组氨酸（HIS4）缺陷型巴斯德毕赤酵母GS115中,并使用抗生素G418筛选、三丁酸甘油酯-MM板及PCR方法筛选获得高表达的重组子。重组子在甲醇诱导下表达产酶,以橄榄油为底物分析脂肪酶的产酶量,并经SDS-PAGE电泳分析,显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致,为36KD。本文进一步优化了发酵条件,包括对培养基组分、诱导剂浓度和发酵温度等的优化。优化后的培养基组成为:甘油4.0%,（NH₄）₂SO₄ 5.0g/L,CaSO₄ 0.465 g/L,K₂SO₄9.10 g/L,MgSO₄·7H₂O 7.45 g/L;培养条件为:pH6.0,生长阶段温度30℃,诱导阶段采用22℃低温诱导,诱导期每24h补加甲醇浓度为3%。优化后,发酵液中的RML活力最高达到116U/mL,比优化前提高了3.14倍。对重组脂肪酶RML进行酶学性质分析表明:重组酶的最适反应温度为40℃,最适水解反应pH为8.0;该酶偏爱中长链的脂肪酸酯（C8-C12）,最适反应底物为对硝基苯酚月桂酸酯（C12）,对C16长链脂肪酸酯也有较高的活性,对短链酯的活性较弱;金属离子Cu²⁺和Fe²⁺对酶活性有显著抑制作用,Ca²⁺和Mg²⁺对酶活有部分的激活作用。