第一部分:过氧亚硝酸盐诱导Alzheimer样tau蛋白异常修饰及其机制 神经原纤维缠结(NFT)是阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)患者典型的病理特征之一，构成NFT的主要成分是异常磷酸化的微管相关蛋白tau。最新的研究显示NFT中tau蛋白还发生了硝基化修饰。为探讨导致AD患者脑内tau蛋白异常磷酸化、硝基化和聚积的上游因子及其机制，我们在大鼠双侧海马内注射过氧亚硝酸盐(peroxynitrite，PN)的供体SIN-1。免疫印迹结果显示：在SIN-1注射24小时后，海马内tau蛋白的硝基化和磷酸化水平显著升高。侧脑室预先注射PN的天然清除剂尿酸(uricacid，UA)，则可以抑制上述由SIN-1引起的tau蛋白异常修饰。以上结果提示：大鼠海马内注射SIN-1可以有效地生成PN，PN可以同时诱导tau蛋白的硝基化和磷酸化。同时，在SIN-1模型组大鼠海马内还检测到：糖原合酶激酶3-β(glycogensynthasekinase3β，GSK-3β)和p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivitedproteinkinase，MAPK)，包括p38a、p38β和p38δ的活性显著升高，但p38γ、细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)和c-Jun氨基端激酶(c-Junamino-terminalkinase，JNK)的活性则无明显的改变。以上结果提示：GSK-3β和p38的激活可能在PN诱导的tau蛋白的异常磷酸化中发挥重要的功能。为阐明tau蛋白的硝基化在AD的病理过程中如何发挥作用，我们在体外用PN处理纯化的人重组tau蛋白，结果显示PN浓度依赖性地诱导tau蛋白发生硝基化和寡聚化，而且硝基化tau蛋白与微管的结合活性显著下降。进一步研究发现：用PN处理稳定表达tau蛋白的N2a细胞，可以诱导细胞内tau蛋白的硝基化，而且硝基化的tau蛋白在细胞内发生聚积。在SIN-1模型组大鼠中免疫荧光的结果显示不仅磷酸化tau蛋白在海马神经元内发生聚积，硝基化tau蛋白同样发生了聚积。探讨tau蛋白聚积的机制发现：SIN-1模型组大鼠海马蛋白酶体的活性显著下降。与正常tau蛋白相比，20S蛋白酶体降解磷酸化tau蛋白的效率没有明显下降，但是硝基化tau蛋白呈现出更为无序的二级结构，并且可以部分对抗20S蛋白酶体的降解。以上结果提示：蛋白酶体活性的抑制和tau蛋白的硝基化可能是tau蛋白聚积形成的部分机制。综上所述，我们研究首次表明：过氧亚硝酸盐可以在体诱导tau蛋白磷酸化、硝基化和聚积；硝基化抑制tau蛋白的微管结合活性，并且硝基化的tau蛋白促进tau蛋白聚积的形成；GSK-3β、p38α、p38β、p38δ的激活和蛋白酶体活性的抑制分别在tau蛋白的异常磷酸化和聚积的形成中发挥重要作用。我们的研究还揭示PN是诱导tau蛋白AD样的异常修饰的共同上游因子，可以做为AD治疗的潜在靶点。 第二部分:CHIP降解tau蛋白特性研究 神经原纤维缠结(NFTs)是阿尔茨海默病典型的脑病理特征之一，构成NFTs的主要成分是异常磷酸化的tau蛋白。最近研究发现：CHIP(carboxylterminusofHsc70-interactingprotein)是tau蛋白特异性的泛素连接酶3。在体外，CHIP可以促进tau蛋白的降解。但在体CHIP降解tau蛋白的特性还不清楚。另外，CHIP介导tau蛋白泛素化的方式目前还存在争议。在我们的研究中，用立体定位注射技术将CHIP质粒导入大鼠双侧海马来研究CHIP对tau蛋白的降解特性。在CHIP质粒注射后，在24小时内CHIPmRNA和蛋白表达水平都呈时间依赖性的显著升高。同时，CHIP质粒转染鼠脑中总tau蛋白以及在PHF-1位点磷酸化和在tau-1位点非磷酸化的tau蛋白水平均显著下降，且这种下降和CHIP的增加负相关。CHIP蛋白表达增加并不影响tau蛋白的mRNA水平和蛋白酶小体的活性。以上结果提示在正常大鼠脑内CHIP可以调节tau蛋白的降解且不依赖与tau蛋白的磷酸化状态。我们进一步检测CHIP能否降解异常磷酸化的tau蛋白。通过侧脑室注射wortmannin和GFX来复制tau蛋白磷酸化的动物模型。我们发现和模型组相比，在CHIP过表达的鼠脑内，在PHF-1位点过度磷酸化的tau蛋白水平显著下降，而CHIP并不抑制wortmannin/GFX诱导的GSK-3β的激活。以上结果提示：在鼠脑内CHIP过量表达可以促进异常磷酸化tau蛋白的降解。用激酶GSK3β的激活剂wortmannin或酯酶抑制剂岗田酸(OA)处理N2a细胞以诱导AD样tau蛋白磷酸化的细胞模型，同时在N2a细胞瞬时转染CHIP质粒，免疫荧光结果显示过量表达CHIP可以降低tau蛋白在pS214和pS396位点的磷酸化水平并显著抑制磷酸化tau蛋白的聚积。以上结果提示过量表达CHIP可以促进异常磷酸化tau蛋白的降解。免疫共沉淀发现tau蛋白、Hsc70和CHIP二聚体共存。为确定在CHIP和tau蛋白的相互作用中是否需要Hsc70，我们首先将大鼠海马匀浆液用Hsc70抗体进行免疫沉淀，离心后得到的上清再用tau蛋白的抗体进行免疫沉淀。结果发现：用Hsc70抗体进行免疫沉淀去除Hsc70后，再用tau蛋白的抗体进行免疫沉淀仍然可以观察到tau蛋白和CHIP二聚体复合物。以上结果提示在没有Hsc70的情况下，CHIP二聚体仍可和tau蛋白直接相互作用。CHIP二聚体可能通过一种新的非Hsc70依赖的方式来发挥其作用。氯化锂可以在细胞水平上调CHIP蛋白的表达。总之，我们的结果首次提供在体证据：二聚体CHIP在生理和病理条件下对tau蛋白的降解都是很关键的，二聚体CHIP可能通过非Hsc70依赖性的方式发挥作用。过表达CHIP可能是抑制NFTs形成的潜在治疗手段之一。 第三部分:一氧化氮通过激活GSK-3β诱导tau蛋白磷酸化 AD病人脑内的典型病理特征之一是神经原纤维缠结(NFTs)，其主要是由异常磷酸化的tau蛋白组成。在NFTs中，可检测到一氧化氮(Nitricoxide，NO)的存在。但是NO与tau蛋白磷酸化的关系尚不清楚。我们的研究发现：由广泛应用的NO的供体硝普钠(odiumnitroprusside，SNP)产生的NO，在HEK293/tau441细胞中可以诱导tau蛋白在Ser396/404andSer262位点发生磷酸化，同时可检测到糖原合酶激酶(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)的激活。在SNP处理细胞前用GSK-3的抑制剂10mM的氯化锂(lithiumchlorideLiCl)预处理1个小时，则可以抑制由SNP诱导的tau蛋白的磷酸化改变和GSK-3β的激活。本实验首次证明在体外NO可以诱导AD样tau蛋白磷酸化，GSK-3β的激活是NO诱导tau蛋白磷酸化的机制之一。NO可能是在AD病人脑内导致tau蛋白磷酸化的上游因子。