目的:砷是自然界中广泛存在的类金属元素,可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入体内,造成多器官、系统的损伤。我们学院和瑞士联邦水研究院合作开发的“砷污染风险评估模型”,预测我国高砷暴露人口可能高达2000万。砷是国际癌症研究属确定的人类致癌物,可引起皮肤癌、肺癌和膀胱癌。研究显示,不仅持续性砷暴露可引起肿瘤,而且在停止砷暴露几十年后,膀胱癌和肺癌的发生风险仍然很高。我们研究组体外细胞实验已观察到长期低浓度亚砷酸钠处理的人正常膀胱上皮细胞增殖速度明显加快,出现恶性转化倾向。因此,探索砷致膀胱癌机制,寻找有效的预防控制措施和治疗方案尤为重要。由于砷本身不引起点突变,对其致癌机制的研究更多倾向于后生化机制,即通过扰乱特殊位点的外遗传控制,导致异常基因表达而致癌。我们先前的研究发现低浓度砷能够诱导人正常膀胱上皮细胞原癌基因表皮生长因子受体2（HER2）表达增高。HER2是表皮生长因子受体（EGFR）家族成员,其活化后,可激活多条与细胞增殖、生存、侵润和血管发生有关的信号通路,在乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤中高表达。由于HER2在上皮癌的发生、发展、侵润和转移中发挥重要作用。因此,如果能以HER2为切入点,探索砷诱导膀胱上皮细胞HER2增加在其下游肿瘤发生相关信号通路中的调控作用,将有助于我们揭示砷致膀胱癌的机制,为制定高砷暴露人群膀胱癌的预防和治疗方案提供科学数据。研究方法:体内实验:本研究选用60只健康F344初断乳5周雌性大鼠（70-80g）,经一周适应环境后,随机分成3组,每组20只,经饮水染毒。三组分别为饮蒸馏水的对照组;50mg/L亚砷酸盐iAsⅢ染毒组;200mg/L DMA^V染毒组。各组大鼠自由饮水,染毒12周处死。用原子吸收分光光度计检测大鼠尿中三个处理组不同形态砷含量。用HE染色检测大鼠膀胱上皮细胞增殖情况,用RT-PCR检测大鼠膀胱上皮细胞增殖因子的mRNA表达水平,用免疫荧光,免疫组化技术检测大鼠膀胱上皮细胞HER2活化上述相关因子的蛋白表达水平。采用ELISA技术检测大鼠尿液中生长因子（EGF、TGFα、s E-cad）的表达水平。体外实验:本研究选用人正常膀胱上皮细胞系（SV-HUC-1）,购自美国典型菌种保藏中心（ATCC,编号:CRL-9520）,常规培养于F12K完全培养基（10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml链霉素）中,隔日换液,待细胞生长至85-90%融合后,以0.25%胰蛋白酶消化传代。短期砷处理细胞培养:细胞消化传代后,将细胞接种至60 mm培养皿中,待细胞进入对数生长期,以F12K完全培养基配置各染毒浓度（0、1、2、4、8、10μM）NaAsO2溶液,持续培养24 h。细胞分别加入30 nM NC阴性对照,E-cad或EGFR siRNA,预处理4h后,对细胞进行短期砷处理;加入10μg/ml EGF中和抗体,5μg/ml TGFα中和抗体,10μM GA（HSP90抑制剂）,50 ng/ml EGF重组蛋白,5 ng/ml TGFα重组蛋白,50 ng/ml E-cad重组蛋白,10 ng/ml HSP90重组蛋白,100 ng/ml IL-6重组蛋白和10 ng/ml NDRG1重组蛋白,预处理30 min后,对细胞进行短期砷处理。用RT-PCR检测HER2的mRNA表达水平,用免疫荧光,Western Blot技术检测HER2活化上述相关因子的蛋白表达水平。用免疫共沉淀技术检测HER2活化与伴侣蛋白HSP90之间共表达情况。长期砷处理细胞培养:细胞消化传代后,培养于无NaAsO2的完全培养液中24 h,待细胞完全贴壁,恢复生长状态后,将培养液换成含0.5μM NaAsO2的完全培养液,继续培养24-48 h。如此反复,长期培养40周,建立砷诱导的膀胱上皮细胞恶性转化模型,同时设立长期培养对照组。细胞分别加入30 nM NC阴性对照,EGFR或HER2 siRNA,加入10μg/ml EGF中和抗体,5μg/ml TGFα中和抗体,10μM GA（HSP90抑制剂）,50 ng/ml E-cad重组蛋白,100 ng/ml IL-6重组蛋白和10 ng/ml NDRG1重组蛋白,预处理24h后,细胞收板测定。采用MTS法检测细胞活力,Transwell迁移实验和细胞划痕检测细胞的迁移能力。使用Western Blot技术检测HER2活化上述相关因子蛋白表达水平。采用ELISA技术检测细胞培养液中生长因子（EGF、TGFα、sE-cad）的表达水平。我们采用SPSS19.0软件对结果进行数据分析,实验结果是均数±标准差表示。我们选用单因素方差分析（ANOVA）来比较各实验组与对照组之间的统计学差异,组间的比较采用Dunnett’s T3检验。两独立样本间比较采用t检验。p<0.05是差异有统计学意义。结果:1 F344大鼠尿中砷形态含量亚砷酸盐和DMA^V处理组的大鼠24h尿中各种形态砷的浓度和含量明显高于对照组。2长期砷处理导致F344大鼠膀胱上皮增生在DMA^V治疗的大鼠中,膀胱上皮细胞增生的严重程度明显高于亚砷酸盐处理组的大鼠。两个染毒组细胞增生的严重程度明显高于对照组。3长期砷处理对大鼠膀胱上皮细胞EGFR和HER2蛋白及磷酸化表达的影响与对照组相比,亚砷酸盐和DMA^V处理组大鼠膀胱细胞中EGFR和HER2蛋白表达和磷酸化表达均显著升高,但两个处理组之间的差异无统计学意义。4长期砷处理对大鼠膀胱上皮细胞EGF,TGFα,E-cad,sE-cad蛋白表达的影响与对照组比较,两个砷处理组大鼠膀胱上皮细胞中EGF、TGFα蛋白表达水平明显增高、E-cad蛋白表达水平明显降低。DMA^V处理组的EGF和E-cad与亚砷酸盐组相比,蛋白表达有明显统计学差异。5长期砷处理对大鼠膀胱上皮细胞HSP90,IL-6,NDRG1蛋白表达的影响与对照组比较,两个砷处理组大鼠膀胱上皮细胞中HSP90蛋白表达水平明显增高、NDRG1蛋白表达水平明显降低,IL-6蛋白表达水平不变。DMA^V处理组的HSP90与亚砷酸盐组相比,蛋白表达有明显统计学差异。6长期砷处理对大鼠膀胱上皮细胞增殖因子蛋白表达的影响与对照组比较,两个砷处理组大鼠膀胱上皮细胞中CCND,COX-2的mRNA表达水平明显增高、CCND,COX-2,PCNA,KI67蛋白表达水平明显增高,PCNA mRNA表达水平不变。7短期亚砷酸钠染毒对SV-HUC-1细胞HER2表达及磷酸化的影响短期亚砷酸盐能刺激SV-HUC-1细胞HER2磷酸化;用2μM亚砷酸盐处理细胞24h时,HER2的磷酸化水平达到最高。8短期亚砷酸钠染毒对SV-HUC-1细胞EGFR表达及磷酸化的影响短期亚砷酸盐能刺激SV-HUC-1细胞EGFR磷酸化;用2μM亚砷酸盐处理细胞24h时,EGFR的磷酸化水平达到最高。与HER2的磷酸化变化趋势完全一致。9在短期亚砷酸钠处理的SV-HUC-1细胞中,EGFR参与HER2磷酸化的激活亚砷酸钠活化的HER2依赖EGFR的激活作用,EGFR参与HER2的活化过程。10短期亚砷酸钠染毒对SV-HUC-1细胞外生长因子表达的影响在砷处理的膀胱上皮细胞中,EGF、TGFα、sE-cad蛋白水平明显高于对照组,E-cad的蛋白水平显著低于对照组。11在短期亚砷酸钠处理的SV-HUC-1细胞中,EGF参与HER2磷酸化的激活在亚砷酸盐处理的膀胱上皮细胞中,EGF配体能刺激HER2磷酸化。12在短期亚砷酸钠处理的SV-HUC-1细胞中,TGFα参与HER2磷酸化的激活在亚砷酸盐处理的膀胱上皮细胞中,TGFα配体能刺激HER2磷酸化。13在短期亚砷酸钠处理的SV-HUC-1细胞中,E-cad不参与HER2磷酸化的激活在亚砷酸盐处理的膀胱上皮细胞中,E-cad与HER2磷酸化存在相互抑制,而且E-cad降低不是刺激HER2磷酸化的原因,而是HER2磷酸化可以抑制E-cad。14短期亚砷酸钠染毒对SV-HUC-1细胞内HSP90,NDRG1,IL-6表达的影响在砷处理的膀胱上皮细胞中,HSP90蛋白水平明显高于对照组,NDRG1,IL-6的蛋白水平显著低于对照组。15在短期亚砷酸钠处理的SV-HUC-1细胞中,HSP90对HER2磷酸化的影响在亚砷酸盐处理的膀胱上皮细胞中,HSP90作为分子伴侣蛋白与磷酸化HER2相互作用。16在短期亚砷酸钠处理的SV-HUC-1细胞中,IL-6,NDRG1对HER2磷酸化的影响在亚砷酸盐处理的膀胱上皮细胞中,NDRG1,IL-6与p-HER2水平呈负相关。此外,砷暴露的SV-HUC-1细胞p-HER2水平升高可能是由于亚砷酸盐抑制IL-6表达之后下调NDRG1蛋白水平所致。17长期砷处理对SV-HUC-1细胞活力,增殖迁移水平的影响SV-HUC-1细胞经0.5μmol/L NaAs O₂处理40周后,细胞活力,增殖迁移水平明显高于对照组。18长期砷处理对SV-HUC-1细胞相关细胞因子蛋白表达影响SV-HUC-1细胞经0.5μmol/L NaAsO₂处理40周后,EGFR和HER2的磷酸化、TGFα、HSP90、增殖因子COX2、PCNA和CCND的蛋白表达水平显著增加,细胞中的E-cad,IL-6和NDRG1蛋白表达显著降低;在培养液中TGFα、EGF和sE-cad蛋白也显著增加。而EGFR和HER2总蛋白表达始终不变。19长期砷处理SV-HUC-1细胞增殖和迁移中的EGFR和HER2作用EGFR和HER2的基因敲除都可显著抑制长期亚砷酸盐处理细胞的增殖和迁移能力。20长期砷处理SV-HUC-1细胞中参与EGFR和HER2激活的相关因子作用在亚砷酸盐处理的SV-HUC-1细胞中,HER2可以通过与EGFR的异源二聚化作用被激活,并且由于EGFR和HER2的活化,引起E-cad、sE-cad、NDRG1、IL-6、COX2、CCND和PCNA的表达的改变,而TGFα、EGF和HSP90的上调表达可能不能通过EGFR和HER2的激活来介导。21长期砷处理SV-HUC-1细胞中EGF,TGFα,HSP90激活EGFR和HER2磷酸化的作用在亚砷酸盐处理的细胞中TGFα、EGF和HSP 90均能参与调控EGFR和HER2的磷酸化。22长期砷处理SV-HUC-1细胞中E-cad,IL-6,NDRG1抑制EGFR和HER2磷酸化的作用在亚砷酸盐处理的细胞中IL-6和NDRG1均能参与调控EGFR和HER2的磷酸化。且过程可逆。结论:1、体内外实验均证明长期、低剂量砷处理能够诱导正常膀胱上皮细胞发生增殖。2、动物实验:饮水12周染砷组大鼠膀胱上皮细胞中,EGF,TGFα,sE-cad,HSP90,EGFR,HER2,p-EGFR,p-HER2和增殖因子PCNA、CCND和COX2表达升高;IL-6不变;NDRG1,E-cad表达降低。3、细胞实验:短期和长期染砷的膀胱上皮细胞中,EGF,TGFα,sE-cad,HSP90,p-EGFR,p-HER2和增殖因子PCNA、CCND和COX2表达升高;EGFR,HER2不变;IL-6,NDRG1,E-cad表达降低。4、在亚砷酸盐处理的细胞中TGFα、EGF和HSP 90参与调控EGFR和HER2的磷酸化,是一个不可逆的调节作用。5、在亚砷酸盐处理的细胞中IL-6,NDRG1抑制EGFR和HER2的磷酸化过程,是一个可逆的相互调节的作用。