论文部分内容阅读
目的:探讨肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中神经降压素/白介素8(neurotensin,NTS/interleukin-8,IL-8)信号通路的具体分子机制及其与HCC侵袭性和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系。方法:随机选取100例经部分肝切除术治疗的HCC患者石蜡组织切片标本,同时收集患者的临床病理资料。利用免疫组织化学方法分别检测NTS、神经降压素受体1(neurotensin receptor 1,NTR1)、IL-8、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)、分化抗原群68(cluster of differentiation 68,CD68)、CD163、CD31等炎性反应指标,Ecadherin、β-catenin等EMT指标的表达。分析NTS/IL-8通路活化与HCC临床病理指标的相关性。细胞学实验选取了高表达NTS低表达NTR1的Hep3B细胞,通过基因转染技术和RNA干扰技术构建不同NTR1表达水平的HCC细胞系。利用ELISA实验检测不同NTS处理和不同NTR1表达水平的Hep3B细胞IL-8分泌的差异。利用划痕修复实验、Transwell实验和Western Blot观察阻断IL-8受体后给予NTS刺激,HCC细胞侵袭转移和EMT特征的改变。利用Western Blot和核ELISA探究HCC细胞中NTS调控IL-8分泌的具体分子机制。通过SP600125、PD98059、SB203580和BAY117082分别阻断MAPK和NF-κB信号通路来观察NTS诱导的HCC细胞分泌IL-8、侵袭能力和EMT的变化。结果:在100例HCC标本中,NTS高表达的标本占19%(19/100),NTR1高表达的标本占41%(41/100),IL-8高表达标本占49.0%(49/100)。Spearman秩相关分析表明:NTS与NTR1的表达显著正相关(r=0.322,P=0.001),在19例NTS+的HCC标本中,有14例(73.68%)高表达NTR1,这提示大部分NTS信号激活的样本中存在NTR1的高表达。NTS与IL-8的表达显著正相关(r=0.331,P=0.001)。在19例NTS+的HCC标本中,有16例(84.21%)高表达IL-8,这提示在大部分NTS+的HCC组织中存在NTS/IL-8通路活化。NTS/IL-8通路活化与HCC患者肿瘤包膜和门静脉癌栓侵润等转移指标密切相关(P=0.048,P<0.01)并且NTS+IL8+双阳性的HCC患者预后不良,其OS明显短于单阳性和阴性患者(P=0.019)。NTS/IL-8通路活化与肿瘤侵袭指标MMP-9、血管生成指标VEGF、炎症指标CD31、M2型TAM均呈正相关(P=0.001,P=0.020,P<0.001,P<0.001)。并且NTS/IL-8活化HCC的标本中E-cadeherin表达显著减少,β-catenin在细胞浆内聚积,N-cadherin表达明显增加(P=0.026,P=0.040,P=0.003),提示NTS/IL-8通路活化与肿瘤细胞EMT密切相关。外源性NTS刺激和升高NTR1表达可以促进Hep3B细胞分泌IL-8(P=0.005,P=0.03),当阻断NTR1可显著降低其中IL-8的表达(P=0.005),提示外源性NTS刺激和升高NTR1表达可诱导Hep3B细胞中NTS/IL-8通路活化。而阻断IL-8受体后,Hep3B细胞划痕修复率(P<0.001)和侵袭细胞数(P=0.002)显著降低,同时E-cadeherin表达增加,N-cadherin和β-catenin的表达降低,提示NTS/IL-8通路活化可在体外刺激Hep3B细胞发生EMT,而该作用可被IL-8受体阻断剂部分逆转。NTS刺激IL-8的分泌与MAPK和NF-κB通路的激活有关,而与PKC通路和PI3K通路无关。Western Blot显示了P38、ERK、JNK和IκB、P65均出现了磷酸化激活,核ELISA的结果也证实了NF-κB家族中的P65和P50入核表达。阻断NTR1后,MAPK和NF-κB通路蛋白磷酸化水平显著降低。通过SP600125、PD98059、SB203580和BAY117082分别阻断MAPK和NF-κB信号通路后,HCC细胞凋亡未出现明显差异,但IL-8分泌水平显著降低,侵袭和迁移能力显著下降,同时EMT出现明显逆转。结论:HCC组织中NTS与IL-8表达显著正相关表明NTS/IL-8通路激活。NTS/IL-8通路激活与肝癌局部炎症和肿瘤EMT密切相关。HCC细胞中NTS可以通过激活MAPK和NF-κB通路刺激IL-8的分泌,增加肝癌细胞EMT和侵袭转移能力,进而导致临床不良预后。