背景:细菌感染常导致许多严重疾病的发生,带来了巨大的公共卫生负担。特别是病原菌对抗生素耐药性的增加,使其有效防治更加困难。其中,细菌生物膜的形成及难以清除是引起细菌产生耐药性和细菌持续性感染的主要因素之一,这推动了对抗菌策略的探索,如:纳米技术、光动力抗菌疗法和微电技术等。光动力疗法是治疗癌症特别是皮肤癌的手段之一。近年来,这种疗法被应用于治疗包括细菌在内的多种感染性疾病,并被命名为光动力抗菌疗法。目前认为其机制为光敏剂由激光激发产生的活性氧能够作用于细胞膜,并进一步破坏生物膜结构或功能单位造成微生物死亡或调亡,这种独特的抗菌机理不易导致细菌产生耐药性。最近有研究发现,碳点又称碳纳米点,是一种类量子点状纳米材料,其光学性质及光催化功能类似于传统纳米半导体,例如有效的光诱导电荷分离形成自由基和阴离子及其辐射重组,不仅可产生荧光发射,还可以驱动各种催化过程,具有较强光动力效应,这些特性使碳点作为光动力抗菌疗法光敏剂具有很好的应用前景。此外近年来有关碳点抗菌作用的研究越来越广泛,有学者合成了由碳点、原卟啉和DNA组成的杂交水凝胶,发现通过碳点能量转移对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)具有杀伤作用。也有学者合成了碳点复合材料,当蓝光照射时间达到60 min时能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的生长。以上研究明确碳点的抗菌性能的同时也体现出了不足,例如细胞毒性大、制备方法繁琐、原材料稀缺、光照时间过长等。因此,本实验首次以柠檬酸、乙二胺及醋酸锌为碳源,通过简单、绿色的水热法制备了溶解性度高、低毒性、光学性能优异的锌掺杂碳点,在蓝光激发锌掺杂碳点的条件下,明确对S.aureus及变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)生长和生物膜形成的抑制作用,并初步探讨相关机制,以期为锌掺杂碳点在该领域的应用提供理论依据。方法:1.锌掺杂碳点的制备采取一步水热法制备锌掺杂碳点,并对其进行透射电子显微镜、荧光光谱、傅立叶红外光谱表征。2.锌掺杂碳点的细胞毒性评价将MC3T3-E1(小鼠前成骨细胞系)及L929(小鼠成纤维细胞系)细胞分别培养于96孔板,并设置空白对照组,以及不同浓度锌掺杂碳点溶液浸提液组(50、75和100μg.ml-1),培养24h后,采用CCK8法检测锌掺杂碳点对以上两种细胞的细胞毒性。3.锌掺杂碳点抗菌性检测选取S.aureus(ATCC25923)和S.mutans(UA159)作为实验菌株,实验分为4组:碳点组,蓝光组,碳点+蓝光组,空白对照组。在单独碳点溶液,单独蓝光照射及两者联合应用条件下分别与1×106 cfu.ml-1的上述菌液共培养24 h,采用快速分光光度法检测各组细菌数量。4.生物膜的检测实验分为4组:碳点组,蓝光组,碳点+蓝光组,空白对照组。在单独碳点溶液,单独蓝光照射及两者联合应用条件下分别与浓度为1×106 cfu.ml-1的S.aureus和S.mutans共培养,48h后将培养的细菌生物膜通过结晶紫染色法检测各组生物膜的形成量。5.扫描电镜观察将浓度为1×106 cfu.ml-1的S.aureus和S.mutans菌液分别与锌掺杂碳点溶液共培养并以蓝光照射40min。将未处理组设为空白对照组。24h后用2.5%戊二醛溶液固定,并在4℃条件下过夜。经乙醇梯度脱水,样品干燥,喷金处理后。通过扫描电镜观察以上2种细菌的生物膜结构及细菌形态。6.抗菌机制的初步研究通过观察加入活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)后,对100μg.ml-1的锌掺杂碳点溶液在蓝光照射40min的条件下,对S.aureus生长及生物膜形成量的影响,探究是否产生活性氧及其在抑菌过程中的作用。实验采用快速分光光度法及平板菌落计数法检测细菌数量,结晶紫染色法检测生物膜形成量。结果:1.锌掺杂碳点的透射电子显微镜检测结果表明成功合成粒径约1.8nm的碳点,为均匀分布的球形纳米颗粒,在高分辨透射电子显微镜下可见碳点不具有明显的晶格结构,为无定型状态;荧光光谱检测结果表明锌掺杂碳点最佳激发波长为342nm,最佳发射波长为440nm,此外具有随激发波长而改变发射波长的性质,即激发依赖性;傅立叶红外光谱检测结果表明锌掺杂碳点表面具有羟基、羧基、氨基、环氧基团等官能团,这些基团赋予了锌掺杂碳点优异的稳定性和溶解度。2.CCK8检测结果锌掺杂碳点的CCK8结果显示当锌掺杂碳点浓度为50、75和100μg.ml-1时细胞毒性测试结果均为1级,均在正常生物安全范围内,说明锌掺杂碳点无明显细胞毒性。3.锌掺杂碳点抗菌性检测结果锌掺杂碳点单独应用时对实验选取2种细菌均无抗菌作用;单独蓝光照射20min时对S.aureus生长有抑制作用,但对S.mutans无作用;两者联合应用时对S.aureus抗菌作用明显增强,蓝光照射10min即可抑制其生长,但对S.mutans生长无明显影响。4.细菌生物膜检测结果锌掺杂碳点单独应用对实验选取2种细菌生物膜的形成均无影响;单独蓝光照射40min时可抑制上述2种细菌生物膜的形成;两者联合应用时抑制作用均明显增强,蓝光照射10min 2种细菌生物膜的形成量均显著减少。5.扫描电镜观察结果锌掺杂碳点与蓝光联合应用可使S.aureus数量减少、细菌形态皱缩、无明显生物膜结构;S.mutans数量减少,无完整生物膜结构。6.抗菌机制的初步研究结果经活性氧清除剂NAC处理后,与碳点组比较菌液浓度,菌落个数及生物膜形成量明显增加。提示锌掺杂碳点联合蓝光后可能通过光催化反应产生活性氧,从而抑制细菌生长及生物膜的形成。结论:1.应用水热法成功制备了锌掺杂碳点,溶解度高,化学性质稳定,荧光性能优异,细胞毒性低;2.锌掺杂碳点联合蓝光后能够抑制S.aureus生长但对S.mutans无抗菌作用,此外能抑制S.aureus及S.mutans生物膜的形成;3.锌掺杂碳点在蓝光照射下可能通过光催化反应产生活性氧从而对细菌产生不可逆损伤。