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脓毒症(Sepsis)是细菌等微生物入侵机体后引起的全身炎症反应,在临床上,重大创伤、烧伤、休克和感染等急危重症患者都可发生脓毒症,一旦诱发成脓毒性休克(Septic Shock)和多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),则治疗困难,预后较差。在脓毒症的临床治疗过程中,大概有30%的病人始终在体内找不到始发的感染灶,多种抗感染治疗对其都没有效果,病情一直未能得到有效的控制,最终发生MODS,随后科学人员研究发现此类病人及相关动物模型常出现显著的肠道细菌易位现象,这些都提示我们肠道细菌在脓毒症、SIRS. MODS的发生发展中起重要作用。肠道菌群是机体内微生物群落的重要组成部分,肠道定植的细菌种类繁多,数量巨大,是维护肠屏障的不可缺少的部分。肠道菌群在调节机体免疫系统发育、机体营养物质代谢、维持肠道内稳态等生理过程中发挥重要作用。最近的临床研究中,变性梯度凝胶电泳(DGGE)等摒弃传统细菌培养基的新兴实验方法,被用于分析肠道疾病和肠道菌群的相互关系,如克罗恩病、肠道移植、溃疡性结肠炎等。鉴于肠道菌群在脓毒症发生发展过程的重要作用,我们可以使用分子生物学方法来研究脓毒症时肠道菌群变化。为此,我们建立脓毒症动物模型,分析各个时间点不同肠段肠道菌群的变化规律并筛选出显著改变的细菌,从而为脓毒症的临床治疗提供进一步的参考。研究一 脓毒症大鼠回肠菌群变化特征目的：研究脓毒症大鼠在各个时间点的回肠菌群结构变化模式,发现改变较为明显的细菌。方法：采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症大鼠模型。实验分为对照组、CLP组,CLP组又进一步分为术后6小时组、12小时组、18小时组和24小时组,一共5组(每组各8只)。采集大鼠近回盲部的回肠内容物,提取细菌DNA,在PCR扩增后,进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),观察肠道菌群在每个时间点的结构变化,在Quantity One软件上进一步分析凝胶条带,对肠道菌群结构进行分析,切取变化明显的凝胶条带,再次PCR扩增,随后在NCBI的BLAST工具上与Nucleotide collection (nr/nt)数据库内细菌基因比对,鉴定其细菌种属,同时制作肠道病理切片,观察肠黏膜形态学变化。结果：脓毒症发生后,大鼠肠黏膜出现不同程度的病理损伤。大鼠回肠菌群DGGE图谱发生改变,各个时间点的回肠菌群结构各不相同。回肠菌群从CLP 6小时开始改变,随着脓毒症的时间延长,与正常菌群的结构差异性增大,在CLP 18小时最为显著,到CLP24小时菌群开始接近正常结构。其中改变较为明显的结构特征：在CLP18小时大肠杆菌(Escherichia coli)数量明显增加,而乳酸杆菌(Lactobacillus)和毛螺旋科细菌(Lachnospiraceae)减少。结论：脓毒症发生后,大鼠肠道结构受到破坏。回肠菌群随着时间的延长,与正常菌群的结构差异性增大,在CLP 18小时最为明显,至CLP 24小时开始缓慢恢复至正常。在此期间,最为突出的细菌变化是大肠杆菌(Escherichia col)数量增加,乳酸杆菌(Lactobacillus)和毛螺旋科细菌(Lachnospiraceae)数量减少。研究二 脓毒症大鼠结肠菌群变化特征目的：研究脓毒症大鼠在各个时间点的回肠菌群结构变化模式,发现改变较为明显的细菌方法：采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症大鼠模型。实验分为对照组、CLP组,CLP组又进一步分为术后6小时组、12小时组、18小时组和24小时组,一共5组(每组各8只)。采集大鼠近回盲部的回肠内容物,提取细菌DNA,在PCR扩增后,进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),观察肠道菌群在每个时间点的结构变化,在Quantity One软件上进一步分析凝胶条带,对肠道菌群结构进行分析,切取变化明显的凝胶条带,再次PCR扩增,随后在NCBI的BLAST工具上与Nucleotide collection (nr/nt)数据库内细菌基因比对,鉴定其细菌种属,同时制作肠道病理切片,观察肠黏膜形态学变化。结果：脓毒症发生后,大鼠结肠黏膜出现不同程度的病理损伤。大鼠结肠菌群DGGE图谱发生改变,各个时间点的结肠菌群结构各不相同。从CLP 6小时开始,结肠菌群结构出现变化,随着时间延长,结构差异性变大,以CLP 12小时最为显著,至CLP 24小时,肠道菌群结构逐渐回复。特征性的改变是从CLP 6小时开始,大肠杆菌(Escherichia coli)数量增加；从CLP 12小时开始,口腔普雷沃菌(Prevotella oralis)数量增加；乳酸杆菌(Lactobacillus)初期数量减少,后期数量增多。结论：脓毒症发生后,大鼠结肠结构受到破坏。菌群结构发生变化,随着时间的延长,与正常菌群结构的差异性增大,在CLP 12小时差异性最为明显,后面逐渐接近到正常结构。其中最明显的细菌改变是CLP 6小时开始的大肠杆菌(Escherichia coli)数量增加；CLP 12小时开始的口腔普雷沃菌(Prevotella oralis)数量增加；乳酸杆菌(Lactobacillus)数量初期减少及后期增加。