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1 研究背景和目的食管癌(Esophageal Carcinoma,ESCA)是世界上常见的恶性肿瘤,其发病率居恶性肿瘤的第八位,死亡率居恶性肿瘤第六位。尤其是中国,更是食管癌的高发地之一。由于早期症状不明显,大多数食管癌患者在确诊时已是晚期,常伴有淋巴结转移或者远处转移。目前食管癌的治疗手段较为单一,靶向药物较少,导致食管癌患者生存率低,预后较差。因此,探讨食管癌发生、发展机制,筛选有效的诊断标志物和特异性的治疗靶点,对于降低食管癌死亡率和提高患者生活质量具有重要的意义。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种特殊类型的内源性非编码RNA。与传统线性RNA不同的是,circRNA的3’端和5’端头尾相接形成闭合的环状结构,这一结构使其更加保守和稳定,从而避免被RNA剪切酶降解。同时,这一特性也赋予了 circRNA许多特殊的生物学功能。近年来,circRNA在恶性肿瘤中的作用备受研究者关注。研究报道,许多circRNA在恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤的发生发展。目前,circRNA在食管癌中的功能与机制尚未完全阐明,因此,筛选和鉴定在食管癌进展中发挥重要作用的circRNA并探索其调控机制,对于开发食管癌诊断、预后分子标志物以及潜在治疗靶点具有重要意义。circRNA参与肿瘤进展往往是通过内源竞争RNA(Competing Endogenous RNA,ceRNA)网络实现的。ceRNA网络主要包括circRNA、lncRNA、假基因和编码蛋白RNA等,这些分子能够作为miRNA应答元件(MicroRNAResponse Element,MRE),竞争性地结合相同的miRNA来调控各自表达水平。其中,作为ceRNA网络中的重要分子,circRNA能通过miRNA海绵作用大量吸附与其相应的miRNA,进而在转录后水平调控相应基因的表达,从而影响恶性肿瘤的生物学行为和发生发展。同时,多项研究证实circRNA在食管癌中异常表达,并且能通过“海绵作用”调控下游miRNA的表达进而抑制或促进恶性食管癌的进展。例如,circ-0006168在食管癌组织中高表达,且能够靶向调节miR-100/mTOR和miR-339-5p/CDC25A通路,进而促进食管癌的进展;在食管癌患者的血浆及食管癌细胞系(EC9706和TE1)中,高表达circ-0004771可作用于miR-339-5p/CDC25A通路从而调节恶性食管癌的进展;在食管癌组织中,高表达circ-0000654能够通过海绵作用吸附miR-149-5p和促进STAT3蛋白的表达,进而促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡;在食管癌组织中,circ-0004370表达显著升高并通过调控miR-1294/LASP1轴促进恶性食管癌的进展;在食管癌组织和细胞系中,高表达的circ-0006948可直接与miR-490-3p结合,靶向癌基因HMGA2的3’ UTR诱导上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transformation,EMT),也在食管癌的发生发展中起重要作用。但是,目前circRNA影响食管癌进展的功能及机制尚不完全清楚,需要进一步阐明。因此,深入研究影响食管癌发生发展过程中circRNA/microRNA/mRNA信号轴的生物学功能,对推动食管癌早期诊断及治疗手段的发展,具有较高的科研价值和临床意义。在第一部分,本研究证实环状RNA circ-0077607(circ-FIG4)在食管癌中显著高表达。circ-FIG4表达水平和食管癌患者临床特征的分析结果显示circ-FIG4高表达与食管癌TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移显著相关,生存分析提示circ-FIG4高表达的食管癌患者生存时间更短,提示在食管癌中circ-FIG4可能是潜在的促癌基因。为了探索circ-FIG4对食管癌恶性生物学行为的影响,本研究开展了一系列体内、体外功能实验。体外实验结果显示,与阴性对照组相比,circ-FIG4沉默组食管癌细胞EC9706和KYSE30的增殖、DNA合成、克隆形成、迁移和侵袭能力显著下调,细胞凋亡水平明显升高。体内实结果显示,circ-FIG4沉默组的裸鼠皮下移植瘤生长速度显著减慢,肿瘤增殖标志物Ki-67显著下降。以上研究结果证实circ-FIG4具有促进食管癌细胞增殖和侵袭、抑制食管癌细胞凋亡的生物学功能,发挥促癌基因功能。circRNA作为非编码RNA,其生物学作用主要是影响编码蛋白的活性和表达,而ceRNA调控网络机制是其重要的作用机制之一。为了阐明circ-FIG4是否通过调控ceRNA网络参与了食管癌的进展,本研究的第二部分通过生物信息学和分子生物学实验筛选并验证了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控网络以及其对食管癌细胞生物学行为的影响。本研究首先筛选并预测了circ-FIG4可以通过竞争性结合miR-99a上调ABHD4的表达,并通过RT-qPCR、Western blotting以及双荧光素酶报告基因实验进一步证实了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控轴的相互作用。本研究的第三部分利用功能回补实验分析了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控网络对食管癌增殖和侵袭的影响。揭示了 circ-FIG4可作用于miR-99a间接促进ABHD4的表达,从而促进食管癌细胞增殖和侵袭等恶性表型,沉默miR-99a或者过表达ABHD4可部分逆转circ-FIG4沉默导致的增殖和侵袭抑制。另外,研究结果证实circ-FIG4/miR-99a/ABHD4通过调控EMT信号通路而调节食管癌的恶性表型。本研究的第四部分分析了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控网络的功能蛋白ABHD4在食管癌中的表达及其临床意义及其对食管癌细胞增殖和侵袭的影响。本研究通过TCGA数据库分析和组织芯片验证,证实ABHD4在食管癌中显著高表达,并且同circ-FIG4相似,高表达ABHD4的食管癌患者生存时间更短。功能实验结果显示,与阴性对照组相比,ABHD4沉默组食管癌细胞EC9706和KYSE30的增殖、DNA合成、克隆形成、迁移和侵袭能力显著下调。以上结果提示ABHD4可能在食管癌中发挥促癌基因功能。综上所述,本研究首次发现并鉴定了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4 ceRNA调控网络在食管癌进展中的生物学功能,揭示了食管癌发生、发展新机制,对寻找食管癌新型药物治疗靶点有着极为重要的理论意义和临床价值。2 实验方法2.1 第一部分2.1.1利用RT-qPCR检测120对食管癌和癌旁组织中circ-0077607(circ-FIG4)的表达;检测4株食管癌细胞系(TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30)和 1 株食管上皮细胞系(Het-IA)中的 circ-0077607(circ-FIG4)的表达。2.1.2采用RT-qPCR法测定circ-FIG4在食管癌组织中的相对表达水平,结合患者的临床信息,分析circ-FIG4表达水平与食管癌患者临床特征(TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移)以及生存预后的相关性。2.1.3设计circ-FIG4反向引物和正向引物,采用PCR法鉴定circ-FIG4的环状RNA特性;通过核酸原位杂交实验确认环状RNA circ-FIG4在食管癌细胞中的定位。2.1.4通过慢病毒转染的方法构建环状RNA circ-FIG4沉默的食管癌细胞系,并采用RT-qPCR鉴定基因干扰的效果。2.1.5对circ-FIG4高表达的食管癌细胞系使用沉默慢病毒观察沉默circ-FIG4对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡表型的影响。2.1.6采用稳定沉默circ-FIG4的食管癌细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察裸鼠体内肿瘤增殖速度、体积的变化。2.2第二部分2.2.1通过生物信息学分析、RT-qPCR筛选并验证circ-FIG4调控的miR-99a。2.2.2采用RT-qPCR分析过表达或沉默circ-FIG4后miR-99a的表达水平;使用双荧光素酶报告基因实验证实circ-FIG4能够直接结合miR-99a。2.2.3分析食管癌组织中circ-FIG4的表达及其与miR-99a的表达相关性。2.2.4利用生物信息学分析、RT-qPCR、Western blotting、双荧光素酶报告基因实验预测并证实miR-99a能够结合并抑制ABHD4的表达。2.2.5 采用 Western blotting 分析 circ-FIG4 通过吸附 miR-99a 促进 ABHD4的表达。2.3第三部分2.3.1将食管癌细胞分为6组,分别为转染阴性对照组(NC)、circ-FIG4沉默组(sh-circ-FIG4)、circ-FIG4 沉默&miR-99a 抑制组(sh-circ-FIG4&miR-99a inhibitor)、ABHD4 沉默组(sh-ABHD4)、ABHD4 沉默组&miR-99a 抑制组(sh-ABHD4&miR-99a inhibitor)和 circ-FIG4 沉默&ABHD4 过表达组(sh-circ-FIG4&ABHD4),观察 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4 轴对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。2.3.2利用上述几组细胞构建皮下移植瘤,观察circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴对裸鼠皮下移植瘤增殖生长曲线、瘤体重量的影响。2.3.3采用生物信息学预测circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴参与食管癌进展的下游潜在的信号通路,通过Western blotting验证EMT信号通路。2.4第四部分2.4.1采用RT-qPCR、Western blotting和免疫组化实验测定ABHD4在食管癌组织中的相对表达水平,结合患者的临床随访信息分析ABHD4表达水平与食管癌患者预后的关系。2.4.2通过慢病毒转染的方法构建ABHD4的稳定沉默食管癌细胞系,并检测沉默的效果。2.4.3通过功能实验分析ABHD4沉默对食管癌细胞增殖和侵袭表型的影响。3研究结果3.1第一部分3.1.1在食管癌组织中circ-FIG4表达显著增加,并与肿瘤组织大小、远处转移、TNM分级等临床恶性表型密切相关。circ-FIG4高表达患者的生存时间明显短于circ-FIG4低表达患者。3.1.2在食管癌细胞中沉默circ-FIG4,其凋亡水平显著增加,而增殖、迁移和侵袭能力显著降低。3.1.3沉默circ-FIG4后,食管癌裸鼠皮下移植瘤的增殖能力显著下降,肿瘤重量明显降低,Ki-67的表达也显著受到抑制。3.2第二部分3.2.1 circ-FIG4能够结合并吸附miR-99a,miR-99a在食管癌中表达显著降低且和circ-FIG4的表达呈显著负相关。3.2.2 miR-99a能够结合并抑制ABHD4的表达且miR-99a和ABHD4的表达呈显著负相关。3.2.3 circ-FIG4能够通过吸附miR-99a促进ABHD4的表达,且circ-FIG4和ABHD4的表达呈显著正相关。3.3第三部分3.3.1功能回补实验证实,沉默circ-FIG4能够显著抑制食管癌细胞EC9706和KYSE30的增殖、DNA合成、迁移和侵袭能力,而抑制miR-99a或者过表达ABHD4能够部分逆转此现象。3.3.2功能回补实验证实,沉默circ-FIG4能够显著抑制食管癌细胞体内裸鼠皮下移植瘤模型的增殖,而抑制miR-99a或者过表达ABHD4能够部分逆转此现象。3.3.3 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4通过EMT信号通路调控食管癌恶性表型。机制回补实验证实,沉默circ-FIG4能够显著抑制食管癌细胞EMT表型,而抑制miR-99a或者过表达ABHD4可部分逆转此现象。3.4第四部分3.4.1 TCGA数据分析证实ABHD4在食管癌中表达明显增高且与患者临床预后密切相关。3.4.2食管癌组织芯片分析进一步证实ABHD4蛋白在食管癌组织中表达明显增高并与患者临床预后密切相关。3.4.3沉默ABHD4的食管癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力显著降低。4结论4.1 circ-FIG4在食管癌中显著高表达,与患者临床恶性表型及生存预后密切相关,是潜在的促癌基因。4.2 circ-FIG4能够通过吸附miR-99a促进ABHD4的表达形成ceRNA调控网络,circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴通过影响EMT通路调控食管癌的生物学行为。4.3 ABHD4在食管癌中显著高表达,与患者临床恶性表型及生存预后密切相关,是潜在的促癌基因。综上所述,本研究证实circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调节轴可调控食管癌的发生及发展,可为食管癌早期诊断和治疗的潜在靶点。