哺乳动物睾丸支持细胞对精子发生的正常进行至关重要,青春期前支持细胞的增殖能力决定成年睾丸生精能力,幼年期为支持细胞的增殖高峰期,青春期后支持细胞不再增殖,因此一旦发育期支持细胞受外源性刺激而不能正常增殖,则不能支持成年期正常的精子发生。本实验室前期研究发现,邻苯二甲酸二丁酯(DBP)体外染毒支持细胞会使其细胞膜损伤,增殖减少、凋亡增加;体内青春期染毒实验证实DBP会引起睾丸脏器系数下降,睾酮水平降低,紧密连接发育受阻,进而导致睾丸发育不全。因此,本研究在前期工作的基础上,拟通过体内和体外实验进行DBP干扰发育期支持细胞增殖的机制研究。首先,通过体外实验,确认来自幼年期的睾丸支持细胞增殖能力强于青春期睾丸支持细胞,并利用基因芯片筛查两种细胞间基因的差异表达;第二,通过体外低浓度MBP(DBP的体内代谢物)染毒实验,利用芯片技术筛选与支持细胞增殖相关的miRNA及其靶基因,探究低浓度MBP染毒促进支持细胞增殖的分子机制;第三,通过DBP体内染毒孕鼠,观察DBP对子代雄性个体生殖系统发育的影响,进一步探究通过干扰支持细胞增殖DBP引起生殖毒性的作用机制。第一部分幼年期与青春期睾丸支持细胞增殖活力比较及mRNA表达谱筛查一、目的比较幼年期(出生后9天)与青春期(出生后21天)大鼠睾丸支持细胞增殖能力的差异二、方法1.大鼠睾丸支持细胞的原代分离、培养及纯度鉴定。2.CCK-8法检测不同时间点(1、2、3、4、5天)两种支持细胞的增殖活力,绘制细胞增殖曲线。3.采用mRNA芯片技术筛选9日龄与21日龄支持细胞中差异表达的基因,采用生物信息学进行基因功能和信号通路相关分析。三、结果1.光镜下可见,随着培养时间的延长,支持细胞首先呈现纺锤形,然后伸出细长突起,呈不规则多边形,有突起,贴壁性较强;细胞免疫荧光鉴定所提支持细胞纯度达到95%以上。2.9日龄大鼠睾丸支持细胞增殖速度明显大于21日龄。在最低接种密度(25000个/ml)组增殖效果最明显。3.在9日龄和21日龄两种大鼠睾丸支持细胞中,541种基因表达有显著性差异,其中257种mRNA表达显著性上调,284种mRNA表达显著性下调(以9日龄为对照组,21日龄为实验组);与9日龄支持细胞相比,转铁蛋白(Transferrin,Tf)上调 12.05 倍,血小板反应蛋白 2(thrombospondin2,Thbs2)下调6.66倍。四、结论大鼠9日龄睾丸支持细胞与21日龄相比具有更强的增殖活力,21日龄支持细胞在功能上则要更加成熟。第二部分DBP干扰发育前大鼠睾丸支持细胞增殖的作用机制研究一、目的体外实验探讨低浓度DBP促进支持细胞增殖的分子机制;体内实验进一步验证在支持细胞发育期DBP染毒,干扰睾丸发育的作用机制。二、方法1.细胞实验(1)CCK-8 法检测不同浓度(Control,0.1mM,1mM,10mM)MBP 分别染毒支持细胞24h、48h对大鼠原代支持细胞活力的影响。(2)不同浓度MBP染毒大鼠原代支持细胞后,光镜下观察细胞形态。(3)miRNA-mRNA表达谱芯片联合筛选并进行生物信息学分析,筛选出与支持细胞增殖相关的miRNA及其对应靶基因,验证其靶向性关系。(4)Real-time PCR技术验证芯片结果的可靠性。(5)不同浓度(0.1mM,1mM,10mM)MBP染毒9d大鼠睾丸支持细胞,检测Rasd1调控G蛋白信号通路下游信号分子MEK的磷酸化水平,验证其对增殖的影响。2.动物实验(1)16只9周龄的雌性SD大鼠随机分为4个大组,即溶剂对照组(Contro1)、低浓度组(50mg/(kg·day))、中浓度组(250mg/(kg·day))、高浓度组(500mg/(kg·day))。以玉米油为溶剂,将DBP稀释成各种浓度,孕12.5-21.5天灌胃给药,测量F1代雄性个体出生后9天肛殖距,并在9、21、90天分别眼球取血并处死,取各脏器备用。(2)检测各个时间点血清中雌二醇和睾酮、FSH、LH含量变化。(3)采用HE染色观察子代雄鼠睾丸结构,免疫组织化学法检测子代睾丸组织中Rasd1及其下游MEK蛋白表达量变化。三、结果1.细胞实验(1)随着MBP浓度升高,细胞增殖活力先上升后下降,在低浓度(O.1mM)MBP染毒大鼠睾丸支持细胞,促进细胞增殖;而在高浓度组(1OmM),MBP明显抑制细胞的生长。(2)随着染毒浓度的增加,支持细胞的形态并未发生明显改变;10mM组细胞数量明显减少,有细胞呈现圆形悬浮在培养基中。(3)经0.1mM MBP染毒原代大鼠睾丸支持细胞24h后,利用芯片miRNA和mRNA表达谱筛查。miRNA结果显示:共有9种miRNA表达变化,其中7种显著性上调,2种显著性下调。与对照组相比,miRNA-328b-3p上调2.81倍,miRNA-329-3p下调-1.26倍。通过比对miRNA数据库发现至少有3种miRNA(miRNA-199a-3p、miRNA-301b-3p、miRNA-3584-5p)及其靶基因 Rasd1 与支持细胞增殖相关。(4)随着MBP浓度增加,所筛选的三种miRNA表达上调,其靶基因Rasd1表达量逐渐下降。(5)靶向性关系结果显示miRNA-301b-3p能与Rasd1的3’UTR区结合,miRNA-3584-5p与Rasd1靶向性关系不明确。2.动物实验(1)高剂量组PND9雄性仔鼠的肛殖距与对照组相比明显缩短。(2)在500mg/(kg·day)实验组血清睾酮的含量在发育过程中明显高于对照组,并且随着发育阶段的推进含量逐渐升高,血清雌二醇含量在三个时间点均高于对照组;FSH和LH在血清中未检测出。(3)DBP染毒最高浓度组(500mg/(kg·day))子代雄性个体睾丸组织在PND9、PND21组可观察到睾丸间质减少,PND90组睾丸组织结构与对照组相比没有明显变化;最高剂量组中PND21 Rasd1表达量明显低于对照组。四、结论低浓度MBP体外染毒促进支持细胞增殖,MBP可通过上调胞内miRNA-199a-3p、miRNA-301b-3p、miRNA-3584-5p 表达,靶向性抑制 Rasd1 蛋白表达,从而使Rasd1对细胞增殖抑制解除,因此促进细胞增殖。体内孕期染毒进一步观察DBP对生殖系统发育的影响,提示DBP可能通过Rasd1参与干扰睾丸细胞增殖,引起睾丸发育异常。