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视网膜新生血管的形成机理与防治的研究已经成为指导临床新生血管性疾病治疗的核心。目前对视网膜新生血管生成机理的研究深入到细胞因子(如VEGF、bFGF、TGFβ等)信号转导通路的层面，但对这些细胞因子信号转导的研究多是在单一因子水平进行，对因子之间的级联通路的研究尚未完全明了。已有许多研究表明TGFβ促进VEGF的表达，也已获知TGFβ有众多的下游通路。是单一通路还是多条通路对VEGF起作用?其具体作用机理如何?我们已经知道Smad通路是TGFβ的主要下游通路之一。以往关于Smad通路对VEGF的影响都是在TGFβ的介导下或是有其它细胞因子干预的研究，由于TGFβ可以激活众多的细胞通路，通过其它的通路的干预VEGF蛋白的表达(如PKC、MAPK等通路)。因而了解单一Smad对VEGF的作用及Smad通路在视网膜新生血管中的作用具有理论与临床意义。第一部分TGFβ对人视网膜血管内皮细胞VEGF、CTGF的影响目的：研究TGFβ对人视网膜血管内皮细胞中P-Smad2，3、VEGF、CTGF蛋白表达的影响。方法：购买人视网膜血管内皮细胞株体外培养，用含10ng／mlTGFβ的ECM各2ml刺激人视网膜血管内皮细胞。分别在作用后1h、2h、6h、12h、24h，应用Westen—Blotting蛋白印迹法检测人视网膜血管内皮细胞中P—Smad2，3、VEGF、CTGF蛋白表达的变化。结果：经TGFβ刺激后人视网膜血管内皮细胞中P-Smad2，3、VEGF、CTGF蛋白的表达增加。P—Smad2蛋白的表达在不同时间组之间无显著性差异(P＞0．05)，不同时间Smad3、VEGF及CTGF的表达有显著性差异(P＜0．05)。CTGF表达在作用后2小时达高峰，VEGF表达逐渐增加，24h达到最高峰。结论：1 TGFβ促进人视网膜血管内皮细胞VEGF、CTGF蛋白的表达，参与视网膜新生血管的形成。2在人视网膜血管内皮细胞中也存在TGFβ／Smad通路，TGFβ促进Smad2、3磷酸化(P—Smad2、3)，激活Smad通路。3 P—Smad2蛋白的表达无时间依赖性，P—Smad3、VEGF及CTGF的表达呈时间相关性。第二部分Smad、VEGF、CTGF级联的相互作用第一章Smad2，3、VEGF基因表达载体的构建目的：构建Smad2，3和VEGF基因表达载体。方法：抽提胎肝组织总RNA，利用RT-PCR扩增得到Smad2，3和VEGF基因的cDNA序列，其中利用引物修饰Smad2，3的开放阅读框，使之能和myc-his表位形成融合基因。纯化、酶切目的基因PCR产物后与真核表达载体pcDNA3．1／myc-his(-)B、pcDNA3．1(-)进行连接。结果：琼脂糖凝胶电泳、PCR、ApaⅠ与KpnⅠ双酶切鉴定结果证实重组pcDNA3．1／myc-his(-)B-Smad2，3、pcDNA3．1／VEGF基因表达载体中所克隆的Smad2，3、VEGFcDNA的长度正确，测序结果证实本实验所克隆的Smad2，3、VEGFcDNA序列与GENE BANK所报道的序列一致。结论：1成功克隆了Smad2，3、VEGF基因的cDNA序列。2成功构建了pcDNA3．1／myc-his(-)B-Smad2，3、pcDNA3．1／VEGF基因表达载体。第二章Smad、VEGF、CTGF级联的相互作用目的：探讨人视网膜血管内皮细胞中VEGF、CTGF和Smad2，3的相互作用。方法：抽提和扩增pcDNA3．1／myc-his(-)B-Smad2，3、pcDNA3．1／VEGF质粒，使用脂质体转染人视网膜血管内皮细胞。分成空白对照组(脂质体组)、脂质体+Smad2基因表达载体组、脂质体+Smad3基因表达载体组、脂质体+VEGF基因表达载体组。转染24小时后使用Real—time PCR和Westen—Blotting蛋白印迹法检测Smad2，3对VEGF和CTGFmRNA和蛋白表达的影响。Real—timePCR检测VEGF对Smad2，3、CTGF mRNA表达的影响。结果：1转染了pcDNA3．1／myc-his(-)B-Smad2质粒后，细胞中Smad2mRNA的表达量比空白对照相比增加了41．4倍，CTGFmRNA增加了2．2倍，同时Smad3mRNA和VEGFmRNA分别下降了33．8倍和40．9倍；P-Smad2、CTGF蛋白较对照组增加，VEGF蛋白较对照组减少。2转染了pcDNA3．1／myc-his(-)B-Smad3质粒后，细胞中Smad2mRNA的表达量与空白对照相比增加了2．2倍，Smad3mRNA表达增加了46．1倍，CTGF增加了2．6倍，同时VEGFmRNA下降了27．6倍；P-Smad3、CTGF蛋白较对照组增加，VEGF蛋白较对照组减少。3转染pcDNA3．1-VEGF质粒后，细胞中Smad2mRNA和Smad3mRNA的表达与对照组相比下降了7．8倍和19．9倍，同时VEGFmRNA和CTGF分别mRNA增加了296．6倍和2．0倍。结论：1基因表达载体成功转染人视网膜血管内皮细胞，目的基因在细胞中高表达，Smad通路被激活。2 Smad2，3均可以显著下调VEGFmRNA和蛋白的表达。3 Smad2，3均可以上调CTGFmRNA和蛋白的表达。4 Smad2及Smad3在人视网膜血管内皮细胞中对VEGF、CTGF，的作用基本相同。5 VEGF可以下调Smad2，3mRNA的表达，上调CTGF的mRNA的表达。