【摘 要】
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目的:比较四种血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)的转染率及安全性,筛选合适的转染载体。方法:健康三色2周龄豚鼠,取后极部巩膜组织培养,免疫荧光鉴定后传代培养,取第
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目的:比较四种血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)的转染率及安全性,筛选合适的转染载体。方法:健康三色2周龄豚鼠,取后极部巩膜组织培养,免疫荧光鉴定后传代培养,取第二代细胞进行实验。实验分为五组:AAV2-EGFP组、AAV5-EGFP组、AAV8-EGFP组、AAV9-EGFP组、空白对照组,分别利用AAV2、AAV5、AAV8、AAV9载体介导EGFP基因按照感染复数(MOI)10、100、1000、10000转染豚鼠巩膜成纤维细胞,对照组加入空白培养基,转染后第2d、3d、4d、5d荧光观察绿色荧光蛋白表达强度及细胞生长状态,流式细胞术检测细胞转染率及细胞凋亡率,CCK8法检测细胞活力。结果:(1)荧光显微镜观察:四种AAV感染豚鼠巩膜成纤维细胞后第2d均可见荧光表达,在AAV2-EGFP组、AAV5-EGFP组和AAV8-EGFP组中,强度随时间延长及MOI值增大而增强,感染第5d,MOI=10000时三组荧光强度最强,其中,AAV8-EGF组荧光强度明显强于AAV2-EGFP组与AAV5-EGFP组。AAV9-EGFP组在各时间点及MOI值均为微弱荧光,空白对照组全程无荧光。(2)流式细胞术检测细胞转染率。当MOI=10000时,转染5d后,各转染组基因转染率由大到小的顺序:AAV8-EGFP组(74.867±4.601)%,AAV2-EGFP组(31.433±2.742)%,AAV5-EGFP组(21.633±0.907)%,AAV9-EGFP组(4.650±0.205)%,各组间进行比较,差异具有统计学意义,P<0.05。AAV8-EGFP组高于AAV2-EGFP组、AAV5-EGFP组和AAV9-EGFP组,差异具有统计学意义,P<0.05。(3)流式细胞术检测细胞凋亡率。当MOI=10000时,转染后第5d,AAV2-EGFP组、AAV5-EGFP组、AAV8-EGFP组、AAV9-EGFP组、空白对照组细胞凋亡率分别为:(4.990±1.432)%、(5.960±0.567)%、(5.490±1.233)%、(5.200±1.186)%、(4.603±1.835)%,各组间相互比较,差异无统计学意义,P>0.05。(4)CCK8法检测细胞活力。转染5d后,MOI=0、10、100、1000、10000时,AAV2-EGFP组在450mM波长处测定OD值分别为:0.478±0.019、0.466±0.023、0.459±0.041、0.465±0.029、0.471±0.021。AAV5-EGFP组为:0.475±0.006、0.500±0.018、0.477±0.022、0.453±0.044、0.474±0.007。AAV8-EGFP组为:0.479±0.014、0.476±0.026、0.476±0.017、0.474±0.019、0.480±0.039。AAV9-EGFP组为:0.481±0.003、0.488±0.010、0.442±0.047、0.479±0.025、0.480±0.052。各组不同MOI值组间相互比较,差异无统计学意义,P>0.05。结论:(1)四种腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞能力:AAV8>AAV2>AAV5>AAV9(2)AAV2、AAV5、AAV8、AAV9介导增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞后对细胞调亡及细胞活力无明显影响,是安全可行的。
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