原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)是世界上常见的恶性肿瘤之一，在中国的发病率和死亡率分别占恶性肿瘤的第3位和第2位，严重威胁到人民的生命和健康安全，每年为此而消耗的大量的人力、物力和财力资源。其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝癌的85％-90％。近年来，肝癌的化疗进展不大，有效率只有50％左右，可能与肿瘤的多药耐药(Multipledrug resistance，MDR)有关。索拉非尼是目前临床上治疗中晚期肝癌首选的靶向药物，但疗效有限，仅延长3个月左右的生存期。　　肿瘤的耐药性分为原药耐药和多药耐药，多数是多药耐药。肝癌MDR产生的机制十分复杂，是多因素、多步骤、多方位相互融合，共同作用的结果。其与ATP结合性盒型转运蛋白超家族、细胞凋亡、DNA甲基化、谷胱甘肽解毒系统、拓扑异构酶Ⅱ及一些信号通路有关。在探讨肿瘤多药耐药产生的各种机制研究中，目前研究最为透彻的就是ABC跨膜转运蛋白超家族的表达异常。ABC跨膜蛋白能够利用ATP水解所产生的能量，将进入到细胞内的化疗药通过药泵作用泵到细胞外，降低胞内的药物浓度，减轻其对肿瘤细胞的杀伤作用，从而导致肿瘤细胞发生耐药。ABC蛋白家族中最常见的是P-gp蛋白，其介导的MDR又被称为MDR的经典途径，是目前研究最清楚的MDR产生途径。　　维拉帕米(Verapamil，VER)是一种在心血管疾病中广泛使用的钙通道拮抗剂。研究表明，VER本身就是P-gp的底物，因此可以与化疗药竞争性结合P-gp，达到逆转耐药的目的。自1981年首次发现其具有逆转肿瘤多药耐药的功能以来，它被作为MDR逆转剂广泛研究和应用，但其逆转耐药的有效浓度远远高于安全浓度，此浓度随之带来一系列的心血管毒性反应，限制了其在临床上的应用。我们首次在国内外通过VER联合TACE治疗HCC，避免了VER带来的心血管系统的不良反应，提高了局部药物浓度，显著提高了临床疗效，远远高出标准化疗方案的效果，但仍有接近30％患者治疗无效，这可能与VER逆转化疗耐药能力个体化差异有关。近年来有报道在卵巢癌紫杉醇耐药细胞株和胃癌阿霉素耐药细胞株中未检测到MDR1高表达。Chiu LY等也通过证实VER逆转肺癌细胞多药耐药与P-gp表达无关。本课题既往研究表明VER的逆转肝癌细胞多药耐药作用与P-gp表达水平并不简单直接相关。这些结果提示，除了通过P-gp外，VER逆转肝癌细胞的耐药性可能存在P-gp外的新靶点。　　近年来，随着生物信息技术的迅速发展，高通量测序技术已成为转录组分析和基因表达新的重要手段。高通量测序技术(High-throughputsequencing，HTS)又称为二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)，其具体应用包括全基因组测序(Whole-genome sequencing，WGS)、全外显子组测序(Whole-Exome Sequencing，WES)和目标基因靶向捕获测序(Targetcapture sequencing，TCS)等。相较传统的Sanger测序，高通量测序技术能够为我们提供详细、特异的信息，最重要的是它的准确率和高特异性，近年来广泛的应用于科研及临床上，已成为现代肿瘤研究的重要技术支撑。　　前期研究中我们通过高通量测序筛选出了一批介导维拉帕米逆转多柔比星化疗耐药能力的靶基因，其中泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)为可能候选靶基因之一。UCHL1（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1）作为泛素羧基末端酯酶家族中的一员，也是一种去泛素化酶。近期的很多研究中发现，UCHL1在许多恶性肿瘤中存在着异常表达现象，同时也揭示了其在肿瘤发生和发展过程中的作用机制。但是，UCHL1的功能在不同肿瘤中是不一样的。在肾透明细胞癌、非小细胞肺癌等肿瘤中，UCHL1被认为是一种癌基因，具有促进肿瘤生长、增殖和转移的功能;而在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中，UCHL1却具有抑癌基因的作用，可以抑制细胞的生长、增殖，并导致细胞凋亡。UCHL1参与调节EGFR表达介导乳腺癌化疗耐药，目前对于UCHL1基因是否参与维拉帕米逆转化疗耐药的调控尚未见报道。本研究通过筛选出有效预测VER逆转化疗耐受/敏感的分子标志物，将为VER联合TACE治疗肝癌提供临床疗效预测手段和理论依据。　　本文主要从以下几方面进行论述：　　第一章 UCHL1介导维拉帕米逆转肝癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选和验证　　目的:UCHL1介导维拉帕米逆转肝癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选和验证。　　方法:1.基于illumina技术测序平台的转录组测序和差异基因的筛选;2.qRT-PCR技术检测UCHL1基因在肝癌细胞中的表达;3.western blot法检测UCHL1基因在肝癌细胞中的表达;4.选取入住我院就诊的中晚期原发性肝癌患者22例，均经肝脏穿刺技术或剖腹探查姑息手术取得病理标本，经病理明确诊断为肝细胞肝癌，每位患者每月行介入治疗1次，共2-4次，评估患者治疗疗效，分为两组:维拉帕米抗耐药治疗有效组(治疗明显好转病例，CR)12例，维拉帕米抗耐药治疗无效组(治疗疾病进展病例，PD)10例，免疫组化法检测UCHL1基因在两组肝癌组织样本中的表达。　　结果:1.以SMMC-7721和BEL-7402为研究对象，基于illumina技术高通量测序筛选，UCHL1为可能候选靶基因之一;2.实时定量PCR法检测UCHL1鸡眼在肝癌细胞中的表达，研究表明:UCHL1基因在7721ADM和7721ADM+VER组表达无明显差异，在7402ADM和7402ADM+VER组表达明显升高;3.westernblot法检测UCHL1蛋白在肝癌细胞中的表达，UCHL1蛋白在7721ADM和7721ADM+VER组表达无明显变化，7402ADM组和7402ADM+VER组比较表达明显升高;4.免疫组化法检测维拉帕米抗耐药治疗有效组(治疗明显好转病例，CR)12例，维拉帕米抗耐药治疗无效组（治疗疾病进展病例，PD）10例UCHL1表达水平。肿瘤组织标本中UCHL1表达水平，采用Image-Pro Plus6.0(IPP)软件分析阳性表达区域的平均光密度值(IOD/area，density mean)。研究表明:UCHL1蛋白主要表达于癌细胞胞核及胞浆中，在癌组织中，有效组的UCHL1平均光密度值明显高于无效组。　　结论:UCHL1介导了维拉帕米逆转肝癌细胞化疗耐药能力差异。　　第二章 改变UCHL1表达水平对VER逆转ADM化疗耐药能力及促凋亡能力的影响　　目的:通过改变UCHL1表达水平，探讨VER逆转ADM化疗耐药能力及促凋亡能力的影响。　　方法:1.建立肝癌细胞UCHL1基因表达沉默及过表达细胞模型;2.CCK8法检测VER逆转ADM化疗耐药能力的变化;3.Annexin V-PI双染法检测VER促肝癌细胞凋亡能力的变化。　　结果:1.在7402细胞中，转染成功UCHL1基因并经验证后，CCK-8法检测该基因表达沉默前后7402细胞ADM及ADM+VER组IC50值变化，VER逆转耐药能力在siR-UCHL1组细胞中明显降低;在7721细胞中，转染成功UCHL1基因并经验证后，CCK-8法检测该基因过表达前后7721细胞中ADM及ADM+VER组IC50值变化，VER逆转耐药能力判定在PCMV6-UCHL1组细胞中明显增强;2.针对7721细胞，ADM组和ADM+VER组细胞凋亡率分别为17.2％、18.6％，ADM组细胞凋亡率与ADM+VER组相比无显著性差异;过表达UCHL1基因水平后，ADM组和ADM+VER组细胞凋亡率分别为16.3％、22.5％，两组相比有显著性差异。针对7402细胞，ADM组和ADM+VER组细胞凋亡率分别为14.9％、23.6％，ADM组细胞凋亡率与ADM+VER组相比有显著性差异;表达沉默UCHL1基因水平后，ADM组和ADM+VER组细胞凋亡率分别为15.8％、18.8％，两组比较有差异，但没有表达沉默前显著，这说明表达沉默UCHL1基因(siR-UCHL1)后，VER促进ADM肝癌细胞凋亡能力较前下降。这说明通过改变UCHL1基因表达水平，可明显改变VER促进ADM细胞凋亡能力，升高该基因的表达水平，VER促进ADM细胞凋亡能力明显增强，反之，降低该基因表达水平，这种能力有所下降。　　结论:通过改变UCHL1基因表达水平，可明显改变VER逆转ADM化疗耐药能力及促进ADM细胞凋亡能力，升高该基因的表达水平，VER可明显逆转ADM化疗耐药能力及促进ADM细胞凋亡能力明显增强，反之，降低该基因表达水平，这种能力有所下降。