狼毒为瑞香科植物瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.、大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata或狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的干燥根,广泛分布于我国东北、华北、西南等地区。狼毒有大毒,临床上用于治疗炎症、水肿、皮肤病、结核和肿瘤等疾病。目前,对于狼毒的研究主要集中于某一类或几种化学成分的提取、分离,而对其药材及制剂中多组分的同时分析及体内代谢研究报道较少。本研究建立了微波辅助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鉴定瑞香狼毒中的化学成分,总结其质谱裂解规律,为全面研究瑞香狼毒的化学组成和质量控制奠定了基础;采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法对东莨菪内酯在大鼠尿液和胆汁中的代谢产物进行鉴定,为东莨菪内酯的临床应用提供重要参考;建立新型中空纤维离心超滤(HFCF-UF)技术联合HPLC法测定3种香豆素类成分的蛋白结合率,为治疗药物监测中蛋白结合率的研究提供有效手段;建立微波辅助提取-离子液体分散液液微萃取-高效液相色谱法测定狼毒制剂结核灵片中6种组分的含量,为全面控制结核灵片的质量提供新的手段。第一部分微波辅助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鉴定瑞香狼毒中的化学成分目的:建立微波辅助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鉴定瑞香狼毒药材中的化学成分,并对其质谱裂解规律进行总结。方法:采用电喷雾离子源,在正、负离子模式下分别对对照品和供试品溶液进行一级和二级质谱扫描,总结对照品的质谱裂解规律。应用“Peak View 2.0”软件中的“Master View”功能对瑞香狼毒供试品溶液的谱图进行分析,通过保留时间、质谱裂解特征并参照文献进行瑞香狼毒中化合物结构的推测、鉴定。色谱条件:采用C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm);流动相:A为含0.1%甲酸的水溶液,B为乙腈;梯度洗脱;柱温25°C;流速0.3 mL/min;进样量2μL。结果:共鉴定了瑞香狼毒中37种化合物(其中香豆素类10种,黄酮类25种,其它类2种),并对其可能的裂解途径进行推测,总结质谱裂解规律。结论:该方法简便、快速,为全面研究瑞香狼毒的化学组成和质量控制奠定了基础,为中药材的定性鉴别提供有效手段。第二部分uplc-q-tof-ms/ms法鉴定东莨菪内酯在大鼠尿液和胆汁中的代谢产物目的:建立uplc-q-tof-ms/ms法鉴定东莨菪内酯在大鼠尿液和胆汁中的代谢产物,探索东莨菪内酯在体内的主要代谢途径。方法:采用电喷雾离子源,正离子模式监测。色谱柱:c18色谱柱(100mm×2.1mm,2.6μm,);柱温:25°c;流动相:水(含0.1%的甲酸)-乙腈(含0.1%的甲酸);梯度洗脱;流速:0.3ml/min;进样体积:5μl。sd大鼠灌胃东莨菪内酯对照品后,分别收集0~72h尿液和0~24h胆汁,与空白生物样品平行制备样品并进样测定,应用metabolitepilot1.5数据处理软件进行东莨菪内酯代谢物的分析、鉴定。结果:鉴定出东莨菪内酯在大鼠体内可能的代谢产物7个,其中,尿液中代谢物7个、胆汁中3个,主要代谢途径为去甲基化、羟基化、水解反应、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化。结论:该方法专属性强、灵敏度高,为东莨菪内酯体内代谢过程的研究以及新的活性成分的发现提供了有效手段。第三部分中空纤维离心超滤-高效液相色谱法测定3种香豆素类成分的蛋白结合率目的:建立新型中空纤维离心超滤(hfcf-uf)技术联合hplc法测定3种香豆素类成分(岩白菜素、瑞香素和东莨菪内酯)的蛋白结合率。方法:将中空纤维切成长度为15cm的小段,分别用甲醇和超纯水超声清洗5s以除去杂质,室温晾干备用。将中空纤维弯成u型置于离心超滤玻璃管中,组成hfcf-uf装置。取空白血浆900μl于1.5ml离心管中,加入混合对照品溶液100μl,涡旋混合30s,将其置于37°c水浴中预平衡30min。取预平衡溶液400μl置于hfcf-uf装置中,将中空纤维两端用封口膜固定,于10000rpm离心10min,取出中空纤维,用注射器推出中空纤维内腔中的超滤液,注入hplc仪,用于待测组分游离浓度的测定。同时另外取预平衡溶液400μl置于hfcf-uf装置中,加入丙酮150μl,涡旋混合30s后进行hfcf-uf,用于待测组分总浓度的测定。根据药物游离浓度和总浓度计算蛋白结合率。分析方法采用diamonsilc18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇:1%乙酸(ph=3.0)=35:65;流速1.0ml/min;进样体积20μl;检测波长327nm;柱温为室温。结果:3种香豆素类成分与血浆中的内源性物质实现了良好分离。各待测组分线性关系良好,相关系数r>0.9996,日内精密度和日间精密度的rsd值分别小于3.3%和3.2%,相对回收率为97.6%~101.0%,绝对回收率为97.5%~100.9%。高、中、低3个浓度水平的qc样品分别经历室温放置24h、-80°c冻存14天和3次冻融(-80°c放置24h后解冻)循环后进样测定的rsd值分别小于4.3%、4.4%和4.4%。结论:本研究建立了一种新型hfcf-uf-hplc法测定3种香豆素类成分的蛋白结合率。该方法通过向血浆样品中加入丙酮作为蛋白结合释放剂使药物从药物-蛋白复合物中释放出来从而测定药物总浓度,进而实现药物游离浓度和总浓度的平行制备与测定。与传统的蛋白结合率的测定方法比较,该方法不需要复杂的样品预处理过程而只需要简单的离心即可进样测定,药物的蛋白结合平衡不被破坏,方法简单、灵密度高、回收率和重现性好。该方法的建立也为治疗药物监测中同时测定药物游离浓度、总浓度和蛋白结合率提供了有效手段。第四部分微波辅助提取-离子液体分散液液微萃取-高效液相色谱法测定结核灵片中6种组分的含量目的:建立简便、新颖、高效的微波辅助提取-离子液体分散液液微萃取结合hplc法测定结核灵片中6种组分(瑞香素、东莨菪内酯、伞型花内酯、西瑞香素、异茴芹内酯和狼毒乙素)的含量。方法:采用微波辅助提取-离子液体分散液液微萃取方法制备供试品溶液。分析方法采用kromasilc18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇(a)和四氢呋喃:1%hac=1:40,ph3.0(b),梯度洗脱;检测波长325nm;流速1.0ml/min;进样体积20μl;柱温为室温。结果:6种待测组分与供试品中其它干扰组分实现了良好分离。各组分的峰面积与浓度线性关系良好,相关系数r大于0.9993。日内精密度和日间精密度的rsd值分别小于4.9%和4.9%。加样回收率范围为96.0%~103.8%,RSD小于4.0%。瑞香素、东莨菪内酯、伞型花内酯、西瑞香素、异茴芹内酯和狼毒乙素的富集倍数分别为43、47、43、41、42和45倍。结论:该方法简单、经济、方便、环保、灵敏度高、溶剂消耗少、分析时间短、富集效率高。该方法的建立为结核灵片的质量控制提供了有效的手段,为中药材及其制剂中的痕量成分的分析提供了一种有效的方法。